一种从亚麻籽粕饼制备高纯度亚麻籽环肽的方法

1.本发明属于农产品的深加工及综合利用领域，具体涉及一种从亚麻籽粕饼制备高纯度亚麻籽环肽的方法。


背景技术：

2.亚麻籽环肽（linusorbs，los），是由8～9个氨基酸环化而成的环肽，分子量大约为960～1100 da，存在于亚麻籽与亚麻根茎中，是亚麻籽所特有的脂质伴随物，且目前并未在其他高等植物中发现。到目前为止，从亚麻籽油中分离鉴定到的环肽有20多种。已发现的常见亚麻籽环肽均含有对氧化敏感的蛋氨酸基团（环肽a、s除外），环肽随着亚麻籽油贮藏时间变化，其巯基被逐步氧化，含有蛋氨酸的亚麻籽环肽首先被氧化成蛋氨酸亚砜的环肽，随后再被氧化成蛋氨酸砜的环肽。亚麻籽环肽结构较为独特，其共价封闭结构可抵抗蛋白酶消化。从结构上看，亚麻籽环肽的环状结构及疏水性质，使其在细胞膜之间的运输、组织和器官之间的分散起到重要的作用。亚麻籽环肽除了免疫调节、抗炎抗癌、抗骨质疏松外，还具有广谱、高效的抗菌活性，抗氧化等作用。
3.亚麻籽环肽作为一种高附加价值的脂质伴随物，目前仅有少数公司可以提供提取物，价格在10000美元/kg左右。环肽在亚麻籽中含量约为300 mg/kg，在亚麻籽油中含量约为1g/kg左右，一般情况下可以通过萃取结合层析等方式，从亚麻籽油中制备亚麻籽环肽，然而有机溶剂的参与（尤其是甲醇），使得经过萃取后的亚麻籽油不可食用，间接导致了亚麻籽环肽的制备成本大幅上升且浪费大量的食用油资源，成本高昂，无法大规模生产。
4.研究发现，经过压榨后的亚麻籽饼粕中，其经济价值较低，但仍然存留相当部分的亚麻籽环肽，含量约为150 mg/kg，是一种较为理想的亚麻籽环肽制备原料。从亚麻籽饼粕制备制备环肽，溶剂萃取法仍然是较为合适的选择。现阶段的研究发现，利用丙酮对亚麻籽饼粕进行萃取后，使用甲醇等极性溶剂对丙酮提取物进行萃取后，可以获得纯度较高的亚麻籽总环肽。但上述工艺路线存在的问题是，丙酮为管制溶剂，如若要扩大生产，丙酮用量过高势必导致企业存在一定的管理风险，同时浸泡过丙酮的亚麻籽饼粕也失去了作为食品原料进一步深加工的可能。也有研究发现，使用乙醇作为替代丙酮的溶剂，具有成本低，来源广和适用于食品加工等特点，然而乙醇提取的选择性较差，提取物中带有亚麻籽饼粕中的多糖类和磷脂类物质，这些物质与亚麻籽环肽的极性接近，在后续萃取中可以被极性溶剂萃取，和环肽同时被富集到极性溶剂中，严重影响亚麻籽环肽的纯度。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种从亚麻籽粕饼制备高纯度亚麻籽环肽的方法。
6.本发明所采取的技术方案是：一种从亚麻籽粕饼制备高纯度亚麻籽环肽的方法，包括如下步骤：s1)将亚麻籽饼破碎，筛分为不同粒径的亚麻籽饼粉；
s2)取粒径小于80目的亚麻籽饼粉，按一定固液比加入乙醇溶液，连续搅拌，得到浓缩后的醇提物；s3)在醇提物中加入非极性溶剂和甲醇水溶液，连续搅拌后，转移至离心管，离心后得分层溶液；s4)取分层溶液中的上层溶液，继续加入甲醇水溶液，连续搅拌后离心，分层；s5)合并分层溶液中的甲醇/水层，浓缩得到亚麻籽粗环肽；s6)在亚麻籽粗环肽中加入水，去除其中的胶质，得到纯化后的亚麻籽环肽。
7.在一些方法的实例中，步骤s2)中，亚麻籽饼粉与乙醇溶液的质量混合比为1：(1～6)，搅拌的时间为5～20 h。
8.在一些方法的实例中，步骤s2)中，乙醇溶液为75～100v/v%的乙醇溶液，优选为95v/v%的乙醇。
9.在一些方法的实例中，亚麻籽饼粉与乙醇溶液的质量混合比为1：(1～6)，搅拌的时间为5～20 h，乙醇溶液为75～100v/v%的乙醇溶液。
10.在一些方法的实例中，步骤s3)中，非极性溶剂选自正己烷、正庚烷、石油醚、6号溶剂中的至少一种。
11.在一些方法的实例中，步骤s3)中，加入非极性溶剂与醇提取物的体积比为5:1～1:1。
12.在一些方法的实例中，步骤s3)中，加入甲醇水溶液与醇提取物的体积比为1:2～1:8；和/或所述甲醇水溶液中，甲醇和水的体积比为 1:1～6:4。
13.在一些方法的实例中，步骤s6)中，亚麻籽粗环肽与水的混合比为1:10～1:50。
14.在一些方法的实例中，步骤s4)重复2～3次。
15.在一些方法的实例中，步骤s2）搅拌温度为20～60℃。
16.在一些方法的实例中，步骤s2)中，通过减压蒸馏浓缩得醇提物。
17.本发明的有益效果是：发明人研究发现，通过对亚麻籽饼粕破碎(非粉碎)，筛分后，利用亚麻籽皮难以被粉碎，颗粒物较大的特性，以物理方式富集饼粕中亚麻籽仁，后以亚麻籽饼粕中的小颗粒（即亚麻籽仁），结合乙醇代替丙酮，富集亚麻籽粕仁中富含环肽的小极性组分；后通过甲醇/水混合溶剂对亚麻籽粕仁的乙醇部位进行萃取，获得富含亚麻籽环肽和磷脂的组分；最后通过后脱胶处理，对富含亚麻籽环肽和磷脂的组分进行水化处理，进一步脱除粗环肽中的磷脂，最终实现对亚麻籽饼粕中环肽的高效富集。同时，经过乙醇处理后的亚麻籽饼粕，仍然可以作为食品级原料进行深加工处理，进一步降低环肽的生产成本。
18.本发明一些实例的方法，对亚麻籽饼的前处理中，根据亚麻籽壳富含纤维，不容易被粉碎；亚麻籽仁纤维含量低，更容易被粉碎，因二者物理特性的不同，以亚麻籽饼为原料，对其进行粉碎后再进行物理筛分，获得颗粒大小不同的组分，可在原料层面大幅度降低制备亚麻籽环肽难度，后通过对粗环肽的纯化处理，进一步减少了亚麻籽环肽产品中，极性物质的含量，提高了环肽的纯度。
19.本发明一些实例的方法中，是从亚麻籽副产物亚麻籽饼中提取的，提高了副产物的增值利用并减少了食用油资源的浪费。
20.本发明一些实例的方法，不需要使用管制试剂丙酮，反应条件更为温和，操作简
便、成本低。
21.本发明一些实例的方法，可以制备得到纯度达80％以上的环肽。
附图说明
22.图1是实施例1中步骤4）所获的亚麻籽粗环肽（提取物）液相色谱图。
23.图2是实施例1中经过步骤6）纯化处理后的水层液相色谱图。
24.图3是实施例1中经过步骤6）纯化处理后的环肽层液相色谱图。
具体实施方式
25.一种从亚麻籽粕饼制备高纯度亚麻籽环肽的方法，包括如下步骤：s1)将亚麻籽饼破碎，筛分为不同粒径的亚麻籽饼粉；s2)取粒径小于80目的亚麻籽饼粉，按一定固液比加入乙醇溶液，连续搅拌，得到浓缩后的醇提物；s3)在醇提物中加入非极性溶剂和甲醇水溶液，连续搅拌后，转移至离心管，离心后得分层溶液；s4)取分层溶液中的上层溶液，继续加入甲醇水溶液，连续搅拌后离心，分层；s5)合并分层溶液中的甲醇/水层，浓缩得到亚麻籽粗环肽；s6)在亚麻籽粗环肽中加入水，去除其中的胶质，得到纯化后的亚麻籽环肽。
26.筛分时，具体可以使用40目、60目、80目、100目筛网叠加后进行物理筛分，得到五种不同目数范围亚麻籽饼粉。
27.乙醇溶液的作用主要在于使亚麻籽环肽溶出，具体的混合比和搅拌时间可以根据需要进行相应的调整，以可以充分溶出环肽，同时少溶出杂质，同时有利于后续浓缩为宜。在一些方法的实例中，步骤s2)中，亚麻籽饼粉与乙醇溶液的质量混合比为1：(1～6)，搅拌的时间为5～20 h。
28.乙醇的浓度可以根据需要进行相应的调整，一般而言，高浓度的乙醇极性相对更弱些，更有利于亚麻籽环肽的溶出，同时减少杂质的溶出。在一些方法的实例中，步骤s2)中，乙醇溶液为75～100v/v%的乙醇溶液，优选为95v/v%的乙醇。95v/v%的乙醇成本相对低廉，易于获得。
29.在一些方法的实例中，亚麻籽饼粉与乙醇溶液的质量混合比为1：(1～6)，搅拌的时间为5～20 h，乙醇溶液为75～100v/v%的乙醇溶液。这样可以更好地溶出亚麻籽环肽，同时避免杂质过多溶出，具有更好的提取效果。
30.在一些方法的实例中，步骤s3)中，非极性溶剂选自正己烷、正庚烷、石油醚、6号溶剂中的至少一种。这些溶剂的安全性高，不会与甲醇水溶液共溶，更有利于去除杂质。
31.在一些方法的实例中，步骤s3)中，加入非极性溶剂与醇提取物的体积比为5:1～1:1。这样可以更好地去除杂质，同时尽可能少的使用非极性溶剂。
32.在一些方法的实例中，步骤s3)中，加入甲醇水溶液与醇提取物的体积比为1:2～1:8；和/或所述甲醇水溶液中，甲醇和水的体积比为 1:1～6:4。
33.在一些方法的实例中，步骤s6)中，亚麻籽粗环肽与水的混合比为1:10～1:50。
34.在一些方法的实例中，步骤s4)重复2～3次。这样可以进一步提高亚麻籽环肽的提
取率，也有利于提高其纯度。
35.搅拌的温度对结果影响不大。在一些方法的实例中，步骤s2）搅拌温度为20～60℃。
36.在一些方法的实例中，步骤s2)中，通过减压蒸馏浓缩得醇提物。这样可以更好地回收溶剂。当然也可以使用其他方法进行浓缩。
37.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明涉及的原料均可从市场上直接购买。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。以下实施例中，如无特别说明，醇的水溶液，醇的浓度均为体积浓度。
38.本发明中涉及到的测定方法：产物中环肽含量的测定1）取少量获得的亚麻籽环肽，使用色谱级甲醇溶解，配置为0.1 mg/ml的溶液；2）使用0.45ul滤膜过滤后注入2 ml进样瓶中，使用hplc进行分析。
39.更进一步优选的，所述检测样品的色谱柱条件为：填料为phenyl～hexyl（2.6μm 150
×
4.6mm）。
40.更进一步优选的，hplc的色谱条件为：流动a相：水；流动b相：乙腈；梯度洗脱程序：流动相b起始浓度为30%，以每分钟1%的速度提升至92%后，保持2 min，流速为0.5 ml。紫外检测波长为214 nm。对环肽a、b、c、d、e、f、g、j、k、l、m、n、o、p的定量使用外标法：分别配置0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/ml的多种环肽单体标准品梯度液，用0.45 μm滤膜过滤，备用。分别将处理好的环肽单体标准品梯度液按上述色谱方法进行hplc测定，记录不同浓度下各个环肽标准品的峰面积。以峰面积为横坐标（x），以环肽e、环肽p标准品的浓度为纵坐标（y），绘制标准曲线。将样品按上述色谱方法进行hplc测定，将获得的峰面积代入标准曲线，即可算出不同品种中环肽单体的含量及纯度。
41.实施例11）亚麻籽饼的前处理：使用粉碎机（bj-50）将500 g亚麻籽饼粉碎，粉碎30 s，用40目、60目、80目、100目筛网进行筛选处理，得到五种不同目数范围亚麻籽饼粉，取80～100目和大于100目数粉末，用于环肽提取；2）含亚麻籽环肽油提取：取步骤1）获得的亚麻籽饼粉400 g，按固液比1:6加入75v/v%乙醇，在30℃水浴条件下连续搅拌12 h，抽滤得到含有75v/v%乙醇溶剂的溶液，采用旋转蒸发仪对所得溶液进行旋蒸提取，得到含有亚麻籽胶、多糖等亚麻籽饼油提取物20 g，然后将固液混合物离心，取上清液；3）亚麻籽环肽的富集：称量步骤2）中所获得的上清液5 g，加入5 ml正庚烷，混匀后加入甲醇水溶液（60v/v%）涡旋2 min，离心，分离出下层澄清溶液。在上层液体中，重复加入5 ml 60 %甲醇水溶液，进行两次涡旋提取，将三次提取获得的下层滤液合并、过滤，获得提取物；4）亚麻籽环肽的浓缩：将步骤3）中获得的提取物采用旋转蒸发仪进行旋蒸提取，在瓶壁会出现一层白色固体粉末，即亚麻籽粗环肽0.1039 g；5）将步骤4）获得的环肽转移至另一容器中；6）在步骤5）所得的含环肽的容器中按照1:10加入纯水，涡旋40 s，离心（10000 r/
min 5 min），所得固体即为除去亚麻籽胶（纯化）后的环肽83.6 mg。经过液相色谱定量，纯度为80.46 %。
42.图1是实施例1中步骤4）所获的亚麻籽粗环肽（提取物）液相色谱图。从图中可以看出，粗提物的中的杂质较多，以大极性多糖和胶杂质为主。
43.图2是实施例1中经过步骤6）纯化处理后的水层液相色谱图。从图中可以看出，水层中的主要成分为大极性多糖和胶杂质，几乎不存在亚麻籽环肽。
44.图3是实施例1中经过步骤6）纯化处理后的环肽层液相色谱图。从图中可以看出，环肽层中的大极性多糖和胶杂质去除的较为充分，具有较高的纯度。
45.实施例21）亚麻籽饼的前处理：使用工业粉碎机（hmb-715）将10 kg亚麻籽饼粉碎，粉碎2 min，用40目、60目、80目、100目筛网进行筛选处理，得到五种不同目数范围亚麻籽饼粉，取80～100目粉末，用于环肽提取。
46.2）含亚麻籽环肽油提取：取步骤1）获得的亚麻籽饼粉5 kg，按固液比1:6加入85v/v%乙醇，在40℃水浴条件下连续搅拌12 h，抽滤得到含有85v/v%乙醇溶剂的溶液，采用旋转蒸发仪对所得溶液进行旋蒸提取，得到含有亚麻籽胶、多糖等亚麻籽饼油提取物1 kg，然后将固液混合物离心，取上清液；3）亚麻籽环肽的富集：称量步骤2）中所获得的上清液0.2 kg，加入200 ml正庚烷，混匀后加入400 ml甲醇水溶液（60v/v%）涡旋40 min，离心，分离出下层澄清溶液。在上层液体中，重复两次加入400 ml 60 %甲醇水溶液，进行两次涡旋提取，将三次提取获得的下层滤液合并、过滤，获得提取物；4）亚麻籽环肽的浓缩：将步骤3）中获得的提取物采用旋转蒸发仪进行旋蒸提取，在瓶壁会出现一层白色固体粉末，即亚麻籽粗环肽3.16 g；5）将步骤4）获得的环肽转移至另一容器中；6）在步骤5）所得的含环肽的容器中按照1:10加入纯水，涡旋30 min，离心（10000 r/min 5 min），所得固体即为除去亚麻籽胶（纯化）后的环肽2.71 g。经过液相色谱定量，纯度为85.76 %。
47.实施例31）亚麻籽饼的前处理：使用工业粉碎机（hmb-715）将100 kg亚麻籽饼粉碎，粉碎3 min，用40目、60目、80目、100目筛网进行筛选处理，得到五种不同目数范围亚麻籽饼粉，取大于100目数粉末，用于环肽提取。
48.2）含亚麻籽环肽油提取：取步骤1）获得的亚麻籽饼粉50 kg，按固液比1：6加入95v/v%乙醇，在50℃水浴条件下连续搅拌12 h，抽滤得到含有95v/v%乙醇溶剂的溶液，采用旋转蒸发仪对所得溶液进行旋蒸提取，得到含有亚麻籽胶、多糖等亚麻籽饼油提取物10 kg，然后将固液混合物离心，取上清液；3）亚麻籽环肽的富集：称量步骤2）中所获得的上清液2 kg，加入2 l正庚烷，混匀后加入4 l甲醇水溶液（60v/v%）涡旋40 min，离心，分离出下层澄清溶液。在上层液体中，重复加入4 l 60 %甲醇水溶液，进行两次涡旋提取，将三次提取获得的下层滤液合并、过滤，获得提取物；4）亚麻籽环肽的浓缩：将步骤3）中获得的提取物采用旋转蒸发仪进行旋蒸提取，
在瓶壁会出现一层白色固体粉末，即亚麻籽粗环肽32.3 g；5）将步骤4）获得的环肽转移至另一容器中；6）在步骤5）所得的含环肽的容器中按照1:10加入纯水，涡旋30 min，离心（10000 r/min 5 min），所得固体即为除去亚麻籽胶（纯化）后的环肽26.4 g。经过液相色谱定量，纯度为81.73 %。
49.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
50.以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。