CD16抗体联合细胞因子体外扩增NK细胞的培养方法与流程

cd16抗体联合细胞因子体外扩增nk细胞的培养方法
技术领域
1.本发明涉及体外扩增nk细胞的方法领域，尤其涉及cd16抗体联合细胞因子体外扩增nk细胞的培养方法。


背景技术：

2.现有的体外扩增nk细胞技术中，细胞培养方法采用赫赛汀、herceptin和pha、retronectin+美罗华抗体+鼠抗人cd161抗体包板、透明质酸+cd16+
3.retronectin等等，还有经典的采用滋养细胞的方法。上述方法在操作过程中容易引入安全性问题(例如多种外源因子或试剂的引入均可能增加细胞质量控制的难度，进而增加临床应用的风险)，且存在操作复杂，导致工艺不稳定及成本较高的问题。


技术实现要素：

4.针对背景技术中存在的问题，提出cd16抗体联合细胞因子体外扩增nk细胞的培养方法。本发明将外周血单个核细胞接种到预包被的retronectin和鼠抗人cd16细胞培养瓶中，并添加含il-2、il-15、il-21和自体血浆的培养基。不使用磁珠分选细胞，也不使用滋养层细胞活化方法，操作简单，成效快，制备成本低，安全性高。可高效扩增nk细胞，14天内细胞扩增148倍。
5.本发明提出cd16抗体联合细胞因子体外扩增nk细胞的培养方法，方法步骤包括：
6.s1、从外周血中分离出单个核细胞；
7.s2、将外周血单个核细胞接种到预包被的retronectin和鼠抗人cd16细胞培养瓶中，并添加含il-2、il-15、il-21和自体血浆的培养基；
8.s3、连续培养14-17天，获得高纯度高活性nk细胞。
9.优选的，培养前需要先制备包被液。
10.优选的，包被液的组成成分包括10mlpbs、35ug retronectin和35ug cd16，混合制备。
11.优选的，具体步骤包括：
12.a、包被：将包被液加入培养瓶，铺匀平放，在4℃条件下，避光过夜；
13.b、采血：采集外周血15ml,将其加入离心管一中备用；
14.c、淋巴细胞分离液分离：向离心管中加入等体积pbs至30ml，混匀后转移至提前添加15ml淋巴分离液的离心管二，在1800rpm/800g，室温条件下离心20min，升降速设为0；
15.d、洗涤pbmc：用吸管将离心后中间白色的pbmc层吸出，在离心管三中加入18-22ml的pbs清洗，在2000rpm条件下离心6min，弃上清；再次用20mlpbs清洗，在1800rpm条件下离心6min，弃上清；使用培养基重悬、混匀、取样，采用typan blue染色计数，1800rpm条件下离心6min，弃上清；
16.e、配制细胞悬液：用40ml培养基重悬细胞、沉淀、混匀；
17.f、接种细胞：取40ml上述的细胞悬液加入培养瓶，添加终浓度30ng/ml的il-15、终
浓度100ng/ml的il-21、终浓度5％的自体血浆、终浓度6000u/ml的il-2，将接种后的培养瓶置二氧化碳培养箱培养；
18.g、培养至4、6、8、11和14天时分瓶培养，期间检测，并在第17日回收细胞。
19.优选的，二氧化碳培养箱的培养条件：温度为37℃，co2浓度为5％。
20.与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
21.本发明将外周血单个核细胞接种到retronectin和鼠抗人cd16预包被的细胞培养瓶中，并添加含il-2、il-15、il-21和自体血浆的培养基。其中抗cd16抗体通过结合nk细胞表位的cd16位点，增强il-15和il-2对nk细胞的刺激，以及adcc对肿瘤细胞的杀伤作用，进而诱导nk细胞活化，获得扩增的效率和纯度更高的nk细胞。上述技术不使用磁珠分选细胞，也不使用滋养层细胞活化方法，操作简单，成效快，制备成本低，安全性高。可高效扩增nk细胞，14天内细胞扩增148倍。nk细胞纯度高，具有很高的临床价值。
附图说明
22.图1为本发明一种实施例中方法流程示意图；
23.图2为14天内nk细胞扩增示意图；
24.图3为流式检测nk细胞的结果示意图。
具体实施方式
25.实施例一
26.本发明提出的cd16抗体联合细胞因子体外扩增nk细胞的培养方法，方法步骤包括：
27.s1、从外周血中分离出单个核细胞；
28.s2、将外周血单个核细胞接种到预包被的retronectin和鼠抗人cd16细胞培养瓶中，并添加含il-2、il-15、il-21和自体血浆的培养基；
29.s3、连续培养14-17天，获得高纯度高活性nk细胞。
30.实施例二
31.本发明提出的cd16抗体联合细胞因子体外扩增nk细胞的培养方法，方法步骤包括：
32.s1、从外周血中分离出单个核细胞；
33.s2、将外周血单个核细胞接种到预包被的retronectin和鼠抗人cd16细胞培养瓶中，并添加含il-2、il-15、il-21和自体血浆的培养基；
34.s3、连续培养14-17天，获得高纯度高活性nk细胞。
35.进一步的，培养前需要先制备包被液。
36.进一步的，包被液的组成成分包括10mlpbs、35ug retronectin和35ug cd16，混合制备。
37.实施例三
38.如图1所示，本发明提出的cd16抗体联合细胞因子体外扩增nk细胞的培养方法，方法步骤包括：
39.a、包被：将包被液加入t75培养瓶，铺匀平放，在4℃条件下，避光过夜；
40.b、采血：采集外周血15ml,将其加入50ml的离心管一中备用；
41.c、淋巴细胞分离液分离：向离心管中加入等体积pbs至30ml，混匀后转移至提前添加15ml淋巴分离液的离心管二，在1800rpm/800g，室温条件下离心20min，升降速设为0；
42.d、洗涤pbmc：用巴斯德吸管将离心后中间白色的pbmc层吸出，在离心管三中加入18-22ml的pbs清洗，在2000rpm条件下离心6min，弃上清；再次用20mlpbs清洗，在1800rpm条件下离心6min，弃上清；使用20ml培养基重悬、混匀、取样，采用typan blue染色计数，1800rpm条件下离心6min，弃上清；
43.e、配制细胞悬液：用40mlgt-t551h3培养基重悬细胞、沉淀、混匀；
44.f、接种细胞：取40ml上述的细胞悬液加入培养瓶，添加终浓度30ng/ml的il-15、终浓度100ng/ml的il-21、终浓度5％的自体血浆、终浓度6000u/ml的il-2，将接种后的培养瓶置二氧化碳培养箱培养；二氧化碳培养箱的培养条件：温度为37℃，co2浓度为5％；
45.g、培养至4、6、8、11和14天时分瓶培养，期间检测，并在第17日回收细胞；
46.h、采用流式检测手段，检测nk细胞表面markercd3、cd56、cd16、cd45。结果见图3，由图3可知细胞培养14天后cd45为63.47％，cd3-cd56+为62.63％。
47.本发明将外周血单个核细胞接种到预包被的retronectin和鼠抗人cd16细胞培养瓶中，并添加含il-2、il-15、il-21和自体血浆的培养基。其中抗cd16抗体通过结合nk细胞表胞的cd16位点，增强il-15和il-2对nk细胞的刺激，以及adcc对肿瘤细胞的杀伤作用，进而诱导nk细胞活化，获得扩增的效率和纯度更高的nk细胞。上述技术不使用磁珠分选细胞，也不使用滋养层细胞活化方法，操作简单，成效快，制备成本低，安全性高。可高效扩增nk细胞，14天内细胞扩增148倍(图2所示)。没有cd16抗体刺激增殖不到100倍。因此本方法得到的nk细胞纯度高，具有很高的临床价值。
48.上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于此，在所属技术领域的技术人员所具备的知识范围内，在不脱离本发明宗旨的前提下还可以作出各种变化。