用于预测辅助生殖技术中成功妊娠的标志物及其应用的制作方法

1.本发明属于人类辅助生殖领域。具体地，本发明提供了一种更可靠和准确的标志物，用于预测辅助生殖技术中成功妊娠的可能性。


背景技术：

2.辅助生殖技术的建立与发展，为不孕症家庭带来了希望。体外受精-胚胎移植（ivf-et）作为主要的辅助生殖技术手段，为不孕症患者提供了有效的治疗方法。然而，其单次移植的临床妊娠率仅为40%-50%，并且有部分患者存在反复植入失败的情况。如何提高胚胎移植的成功率，一直是辅助生殖技术领域的热点和难点问题。成功的妊娠不仅需要发育良好的胚胎，也需要健康的子宫微环境。目前，即使移植经过染色体筛选的遗传学正常的囊胚，其单次成功妊娠的概率也不足65%。研究人员公认子宫微环境因素已经成为制约辅助生殖技术成功的关键因素。
3.子宫通过宫颈和阴道与外界相通。随着微生物组研究的不断深入，越来越多的研究发现生殖道的微生物组组成会影响子宫微环境，可能影响辅助生殖技术成功率（koedooder 等人，2019）。
4.中国专利申请cn112384633a 描述了一种基于阴道内阴道加德纳菌、乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌和变形菌门的相对丰度来预测辅助生殖技术不会导致怀孕的方法。
5.此外，中国专利申请cn103930786a描述了一种基于尿液样品中存在的乳酸菌和葡萄球菌的相对量来预测受试对象怀孕成功或失败的方法。
6.这些预测方法初步探索了泌尿生殖道系统微生物组的组成对于预测辅助生殖技术成功率的可能性。尽管如此，随着微生物组检测技术和医学认知的不断进步与完善，临床实践的不断累积，生殖道微生物对于辅助生殖技术成功率的预测的方法也在不断标准化和精准化，预测的敏感性和特异性也逐渐提高，为选择切实满足临床医疗需求的生物标志物提供了可能。


技术实现要素：

7.本发明的发明人经过标准化和规范化的样本采集、微生物检测和数据分析，发现了利用特定的宫颈菌群作为预测辅助生殖技术妊娠结局的标志物，可以有效预测体外受精-胚胎移植的生化妊娠率和临床妊娠率。
8.为深入了解阴道微生物在预防女性泌尿生殖系统疾病和维持健康方面的作用，2011年jacques ravel等人为对396名北美女性的阴道微生物进行采样并测序，发现育龄期妇女的阴道微生物群能够分为五组，其中四组分别以惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌或詹氏乳杆菌为主，而第五组的乳酸菌比例较低，严格厌氧菌的比例较高，如atopobium, gardnerella 等。【ravel j,et al. vaginal microbiome of reproductive-age women. proc natl acad sci usa.2011】。
9.卷曲乳杆菌是人类阴道微生物群的常见成分。卷曲乳杆菌可以通过自身产生抗菌
剂，同时竞争性排斥病原菌，进而促进宿主的泌尿生殖道健康。
10.惰性乳杆菌是一种最近在阴道内检测到的物种，目前尚不清楚该物种在阴道健康中的作用。不局限于任何理论，本发明人首次发现lactobacilluscrispatus（卷曲乳杆菌）和lactobacillusiners（惰性乳杆菌）在成功妊娠的人群的阴道内的存在具有一定特性。本发明由此提出一种用于预测辅助生殖技术中成功妊娠的标志物及其应用。
11.具体而言，为了实现本发明的目的，本发明采用如下的技术方案。
12.本发明一方面涉及一种用于预测辅助生殖技术中成功妊娠的标志物，所述标志物包括阴道宫颈微生物，所述阴道宫颈微生物包括lactobacilluscrispatus（卷曲乳杆菌）和lactobacillusiners（惰性乳杆菌）。
13.在本发明的一个优选实施方式中，所述阴道宫颈微生物还包括下述菌中的一种或者多种的组合：a)普雷沃氏菌prevotellatimonensis；b)纤毛菌sneathiaamnii；c)粪普雷沃氏菌prevotellacopri；d)羊水普雷沃氏菌prevotellaamnii；e)粪普雷沃氏菌prevotellastercorea；f)布劳特氏菌blautiamassiliensis；g)长双歧杆菌bifidobacteriumlongum。
14.本发明人发现，具有上述菌的情况下，受试者更难以怀孕成功。
15.本发明另一方面还涉及一种用于预测辅助生殖技术中成功妊娠的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测上述阴道宫颈微生物在宫颈分泌物中相对丰度的试剂。
16.在本发明的一个优选实施方式中，根据lactobacilluscrispatus（卷曲乳杆菌）和lactobacillusiners（惰性乳杆菌）的相对丰度来判断受试者样本的菌群类型：clu_1型是指lactobacillusiners（惰性乳杆菌）相对丰度大于或等于59%；clu_3型是指lactobacilluscrispatus（卷曲乳杆菌）相对丰度大于或等于40%；clu_2型是相对丰度不满足clu_1型和clu_3型的菌群类型。
17.在本发明的一个优选实施方式中，clu_3型以卷曲乳杆菌为主，clu_1型以惰性乳杆菌为主，clu_2型是不以卷曲乳杆菌和惰性乳杆菌为主。
18.在本发明的一个优选实施方式中，在clu_2分型中还细分包括clu_2_1型，其中clu_2_1型的判断至少满足以下条件之一：a)普雷沃氏菌prevotellatimonensis相对丰度大于3%；b)纤毛菌sneathiaamnii相对丰度大于1.5%；c)粪普雷沃氏菌prevotellacopri相对丰度大于1%；d)羊水普雷沃氏菌prevotellaamnii相对丰度大于1.5%；e)粪普雷沃氏菌prevotellastercorea相对丰度大于0.5%；f)布劳特氏菌blautiamassiliensis相对丰度大于1%；g)长双歧杆菌bifidobacteriumlongum相对丰度大于0.5%。
19.本发明另一方面还涉及上述用于预测辅助生殖技术中成功妊娠的标志物或检测
试剂盒在制备预测辅助生殖技术中成功妊娠的诊断试剂中的应用。
20.在本发明的一个优选实施方式中，所述辅助生殖技术是体外受精-胚胎移植技术（ivf-et）及其衍生技术，包括卵泡浆内单精子注射-胚胎移植技术(icsi-et)和胚胎植入前遗传学诊断-胚胎移植技术（pgt-et）和冷冻胚胎移植技术（fet）。
21.本发明另一方面还涉及一种预测辅助生殖技术中成功妊娠的方法，所述方法包括以下步骤：（1）采集宫颈分泌物样本；（2）确定宫颈菌群菌种结构；（3）对宫颈菌群进行分类；在本发明的一个优选实施方式中，通过16srdna的高通量测序检测菌群菌种的结构。
22.在本发明的一个优选实施方式中，把待预测菌群类型的样本与3个菌群类型的核心菌种组成进行比较计算yue-clayton’sθ得分，判断得分最高的核心型为样本的菌群类型。
23.可替代的，可根据lactobacilluscrispatus（卷曲乳杆菌）和lactobacillusiners（惰性乳杆菌）的相对丰度来判断受试者样本的菌群类型，菌群类型分为clu_1,clu_2和clu_3三类：clu_3型满足条件：lactobacilluscrispatus（卷曲乳杆菌）相对丰度大于或等于40%；clu_1型满足条件：lactobacillusiners（惰性乳杆菌）相对丰度大于或等于59%；不满足条件a）和b)的则被判断为clu_2型。
24.其中clu_3型以卷曲乳杆菌为主，clu_1型以惰性乳杆菌为主，clu_2型则是以除了前两种菌之外的其他菌种为主。
25.在本发明的一个优选实施方式中，所述方法还包括确定宫颈菌群潜在致病菌的存在，在clu_2分型中含有潜在致病菌一类判断为clu_2_1型，其中clu_2_1型的判断，至少满足以下条件之一：a)普雷沃氏菌prevotellatimonensis相对丰度大于3%；b)纤毛菌sneathiaamnii相对丰度大于1.5%；c)粪普雷沃氏菌prevotellacopri相对丰度大于1%；d)羊水普雷沃氏菌prevotellaamnii相对丰度大于1.5%；e)粪普雷沃氏菌prevotellastercorea相对丰度大于0.5%；f)布劳特氏菌blautiamassiliensis相对丰度大于1%；g)长双歧杆菌bifidobacteriumlongum相对丰度大于0.5%。
26.具体地，利用宫颈菌群分型来预测妊娠结局。对妊娠结局预测分为3个层次，clu_3被预测为妊娠成功率高，clu_2_1被预测为妊娠成功率低，clu_1和clu_2被预测为妊娠成功率中等。根据妊娠结局预测的三个层级结果，建议对即将进入胚胎移植周期的受试者提供告知建议，建议妊娠成功率高的受试者可进行胚胎植入，而对妊娠成功率中和低的受试者个体，建议遵医嘱进行方案调整如阴道微生态治疗，谨慎选择进入ivf周期，尤其是判断为妊娠成功率低的clu_2_1型受试者个体，不建议进入ivf周期。
27.本发明至少具有如下有益的效果：在研究宫颈微生态对辅助生殖技术妊娠结局的影响时，发现了宫颈菌群的组成对妊娠结局的影响，并发现了宫颈菌群中lactobacillus crispatus（卷曲乳杆菌）和lactobacillus iners（惰性乳杆菌）对妊娠结局进行准确预测。特别是，本发明形成对辅助生殖技术人群的妊娠成功率的预测，对是否展开新周期辅助生殖技术的应用进行指导，提高了妊娠成功率。
附图说明
28.图1a：宫颈菌群分类结果pca图；图1b: 宫颈菌群分类结果聚类热图；图2：宫颈菌群分型的菌群丰度分布图；图3：多元回归分析结果。
具体实施方式
29.为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
31.实施例：一、研究人群1、中国医科大学附属盛京医院的生殖中心开展了这项对于宫颈微生态对辅助生殖技术妊娠结局的影响的观察性研究（2021年9月至2022年2月）。共纳入130名女性。
32.纳入标准：（1）胚胎质量和数量：囊胚4bb以上1枚，或d3卵裂期优胚1-2枚（6-10细胞，碎片≤25%）；（2）移植日内膜不少于7mm；（3）年龄21-29岁；（4）近半月无抗生素使用史。
33.排除标准：（1）
ⅲ‑ⅳ
期子宫内膜异位症或严重的子宫腺肌症；（2）严重的输卵管积水；（3）中重度宫腔粘连；（4）合并子宫畸形。
34.二、采集样本于卵泡期采集样本，具体操作如下：（1）将一次性无菌阴道窥器暴露宫颈。
35.（2）用拭子置于受试者宫颈管并旋转获取宫颈分泌物，随后将拭放入样本保存管。
36.（3）样品采集后暂存于-20℃，4小时内转移至-80℃，保存备用。
37.三、妊娠结局的确定（1）胚胎移植14天，检测受试者血清中的β-hcg，如果β-hcg＞=20miu/ml，hcg阳性者定义为生化妊娠。
38.（2）胚胎移植后35天，通过超声观察受试者，检测到阳性胎儿心跳和胎芽，定义为临床妊娠。
39.（3）生化妊娠率=生化妊娠周期数/移植周期数*100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数*100%；四、微生物的dna提取和含量检测4.1样本管进行dna提取（1）用无菌手术剪刀剪下阴道拭子的棉签，将样品放入2ml的pbs(ph=7.0)中彻底涡旋；（2）将悬浮液转移到离心管中并以12,000rpm离心5分钟。除去上清液，保留沉淀物；（3）使用qiaamp dna mini kit(qiagen,valencia,ca)将所得沉淀物进行dna提取；（4）在最终沉淀和洗脱后，将dna样品重新悬浮在蒸馏水中。使用agilent bioanalyzer 2100系统（agilent technologies，santa clara，ca）和qubit 3.0荧光计（life technologies，waltham，ma）评估dna质量和浓度，并在-80℃下储存直至进一步使用。
40.4.2 dna含量测定采用检测细菌16s rdna全长的建库测序方法，该方法检测能够将传统的菌群结构鉴定从“属”级别提升到“种”级别，包括以下步骤：（1）定量提取样本中菌群的总dna，标记为样本a；（2）以步骤（1）样本a的dna为模板，pcr扩增16s rdna全长，并为每一个原始扩增的16s rdna全长加上特异的分子标签umi；（3）将步骤（2）所得扩增产物用tn5酶片段化并构建测序用拼接文库，并标记为a-p；（4）将步骤（2）所得扩增产物环化连接并构建测序用连接文库，并标记为a-l；（5）使用illumina测序仪测序，得到拼接文库a-p和连接文库a-l的测序结果；（6）将步骤（5）的测序结果进行生物信息技术处理分析，获得菌群（种）相对丰度信息。
41.五、宫颈菌群结构和分型1、利用上述方法，获得宫颈菌群（种）的组成结构。
42.2、对宫颈菌群（种）进行菌群类型分类2.1通过聚类方法发现菌群结构类别基于pam聚类方法，在菌种水平将宫颈特征菌聚类为3个群落类型，pca结果和热图展示结果如图1。其中clu_3型以卷曲乳杆菌为主（卷曲乳杆菌丰度》=40%），clu_1型以惰性乳杆菌为主(惰性乳杆菌丰度》=59%)，clu_2型则是以前两种菌之外的其他菌种为主，具体
菌种丰度分布见图2。
43.2.2判断受试者样本的菌群类型在菌种水平通过样本间相似性来对受试样本进行分型判断。具体方法：（1）针对上述步骤聚类所发现的clu_1,clu_2和clu_3三种类型，使用每种类型内菌种的平均值代表每种类型的菌种组成；（2）把受试者宫颈菌群组成与3个核心型的菌种组成进行比较，计算yue-clayton指数；（3）通过菌种水平的yue-clayton指数来测量样本间的相似性，判断指数得分最高的核心型为样本的菌群类型。
44.(4)可替代的，根据2.1中图2发现，可根据卷曲乳杆菌和惰性乳杆菌的相对丰度来判断受试者样本的菌群类型。
45.clu_3型满足条件：a)lactobacilluscrispatus（卷曲乳杆菌）相对丰度大于或等于40%；clu_1型满足条件：b)lactobacillusiners（惰性乳杆菌）相对丰度大于或等于59%；不满足条件a）和b)的则被判断为clu_2型。
46.2.3确定宫颈菌群潜在致病菌的存在判断潜在致病菌的存在，将含有潜在致病菌的clu_2分型划分为clu_2_1型，具体见表2。clu_2_1型的判断，至少满足以下条件之一：a）普雷沃氏菌prevotellatimonensis相对丰度大于3%b）纤毛菌sneathiaamnii相对丰度大于1.5%c）粪普雷沃氏菌prevotellacopri相对丰度大于1%d）羊水普雷沃氏菌prevotellaamnii相对丰度大于1.5%e）粪普雷沃氏菌prevotellastercorea相对丰度大于0.5%f）布劳特氏菌blautiamassiliensis相对丰度大于1%g）长双歧杆菌bifidobacteriumlongum相对丰度大于0.5%六、受试者的妊娠结局受试者的妊娠结局见表1。
47.表1:宫颈菌群的结构组成和妊娠结局
样本号lactobacilluscrispatus卷曲乳杆菌lactobacillusiners惰性乳杆菌菌群分型生化妊娠临床妊娠妊娠成功率预测m0115139480%99%clu_1
‑ꢀ
中yd500760%97%clu_1
‑ꢀ
中m0097455400%76%clu_1
‑ꢀ
低m0115598120%99%clu_1+-中yd501620%99%clu_1+-中yd0782%97%clu_1++中yd1900%99%clu_1++中yd500580%99%clu_1++中yd500810%94%clu_1++中yd400340%81%clu_1++中yd0930%75%clu_1++中m0115496300%71%clu_1++中yd2010%70%clu_1++中yd500780%65%clu_1++中
yd500400%64%clu_1++中yd1400%59%clu_1++中yd501882%0%clu_2
‑ꢀ
中m0108838200%53%clu_2_1
‑ꢀ
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‑ꢀ
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‑ꢀ
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‑ꢀ
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‑ꢀ
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‑ꢀ
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‑ꢀ
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中yd501080%0%clu_2
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中yd500750%0%clu_2
‑ꢀ
中yd502330%0%clu_2
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中yd501800%0%clu_2_1
‑ꢀ
低yd500480%0%clu_2_1
‑ꢀ
低yd5003611%0%clu_2_1+-低yd501351%0%clu_2_1+-低yd500510%0%clu_2_1+-低yd2850%54%clu_2+-中yd1760%0%clu_2+-中yd500020%0%clu_2_1+-低yd500640%0%clu_2_1+-低yd500030%0%clu_2_1+-低yd500880%0%clu_2_1+-低yd500970%51%clu_2++中yd501630%27%clu_2++中yd501530%27%clu_2_1++低yd400140%27%clu_2++中yd501730%14%clu_2++中yd500520%12%clu_2++中yd500740%6%clu_2_1++低yd500770%5%clu_2_1++低yd400470%4%clu_2_1++低yd501970%1%clu_2++中yd2250%0%clu_2++中yd0630%0%clu_2++中yd2890%0%clu_2++中yd400210%0%clu_2++中yd400600%0%clu_2++中yd400350%0%clu_2++中yd501700%0%clu_2++中yd500310%0%clu_2++中yd501840%0%clu_2++中yd501650%0%clu_2++中yd500290%0%clu_2++中yd502170%0%clu_2++中yd501500%0%clu_2++中yd501820%0%clu_2++中yd501250%0%clu_2++中
yd500230%0%clu_2++中yd502010%0%clu_2++中yd502120%0%clu_2++中yd501740%0%clu_2++中yd501780%0%clu_2++中yd500460%0%clu_2++中yd502180%0%clu_2++中yd501600%0%clu_2++中yd502060%0%clu_2++中yd500820%0%clu_2++中yd501870%0%clu_2++中yd502270%0%clu_2++中yd500830%0%clu_2++中m01071755957%0%clu_3
‑ꢀ
高yd5005599%0%clu_3+-高yd5001998%0%clu_3+-高m01134769895%0%clu_3+-高yd5018594%0%clu_3+-高yd24983%0%clu_3+-高yd4029778%0%clu_3+-高yd5000965%0%clu_3+-高m00853068499%0%clu_3++高yd02599%0%clu_3++高yd05599%0%clu_3++高yd4000899%0%clu_3++高yd5010999%0%clu_3++高yd5006997%0%clu_3++高m01027238395%0%clu_3++高yd5020595%0%clu_3++高yd5020392%0%clu_3++高yd12492%0%clu_3++高yd04091%0%clu_3++高yd5002090%0%clu_3++高yd08387%0%clu_3++高yd5012986%0%clu_3++高yd02083%0%clu_3++高yd5001383%0%clu_3++高yd17883%0%clu_3++高yd4000780%0%clu_3++高yd5022578%0%clu_3++高yd5001476%0%clu_3++高yd09974%6%clu_3++高yd5001670%0%clu_3++高yd26070%0%clu_3++高yd5005369%0%clu_3++高yd5016659%0%clu_3++高yd12557%42%clu_3++高m01096712253%19%clu_3++高yd16350%33%clu_3++高yd5003949%0%clu_3++高m00543763540%0%clu_3++高yd4001265%0%clu_3++高yd5007199%0%clu_3++高yd5018945%21%clu_3++高yd5013699%0%clu_3++高yd5003774%0%clu_3++高yd5011699%0%clu_3++高
注：+ 代表阳性，-代表阴性
通过对受试人群的宫颈菌群分型与妊娠结局进行统计，具体见表3，发现宫颈菌群分型clu_3(以卷曲乳杆菌为主)的受试者人群生化妊娠成功率为98%，临床成功妊娠率为82%，显著高于其他型（卡方检验，生化妊娠p值《0.001，临床妊娠p值《0.001）。
48.表2，宫颈潜在致病菌丰度
样本号prevotellaamniiprevotellatimonensisprevotellacopribifidobacteriumlongumblautiamassiliensisprevotellastercoreasneathiaamniim0097455400%0%0%0%0%0%9%m0108838202%0%0%0%0%0%0%m0106062460%3%0%0%0%0%0%yd400550%3%0%0%0%0%0%yd402660%0%0%1%0%0%0%yd500480%16%0%0%0%0%0%yd500880%0%5%0%2%1%0%yd501532%0%0%0%0%0%0%yd501550%12%0%0%0%0%7%yd501800%0%1%0%0%0%0%yd501180%0%0%1%0%0%0%yd500740%0%0%0%0%0%4%yd500770%3%0%0%0%0%0%yd400474%0%0%0%0%0%0%yd5013059%0%0%0%0%0%3%yd5013112%3%0%0%0%0%0%yd502230%9%0%0%0%0%0%yd402800%0%0%0%0%0%5%yd500360%0%8%0%0%0%0%yd501350%0%0%2%1%0%0%yd500510%0%0%0%0%1%0%yd5000218%0%0%0%0%0%0%yd500640%2%0%0%0%0%0%yd500030%0%2%0%0%1%0%
表3：宫颈菌群分型与妊娠结局统计结果分型人数生化妊娠人数临床妊娠人数生化妊娠率临床妊娠率clu_116131181%69%clu_247363477%72%clu_2_12311448%17%clu_344433698%82%通过logistic多元回归分析发现，clu_3 (以卷曲乳杆菌为主)型是生化妊娠和临床妊娠的保护性因素(生化妊娠：or=18.633, p=0.005；临床妊娠：or=3.398, p=0.006)，clu_2_1型是生化妊娠和临床妊娠的危险性因素(生化妊娠：or=0.149, p《0.001；临床妊娠：or=0.068, p《0.001)，见图3。发现宫颈菌群分型可以很准确地对妊娠结局进行分层预测。
49.因此，我们提出通过检测宫颈菌群，进行菌群分型来预测妊娠结局。
50.七、预测受试者的妊娠结局我们利用宫颈菌群分型对妊娠结局成功可能性进行分层预测，分为高、中、低3个层次，clu_3被预测为妊娠成功率高，clu_2_1被预测为妊娠成功率低，clu_1和clu_2被预测为妊娠成功率中等。预测为妊娠成功率高的44名受试者中，43位成功生化妊娠，36位成功临床妊娠，生化妊娠成功率达到98%，临床妊娠率可达到82%；预测为妊娠成功率低的23名受试者中，11位成功生化妊娠，4位成功临床妊娠，生化妊娠成功率为48%，临床妊娠率仅到17%，
详细预测结果如表4和表5。
51.表4：基于宫颈阴道分型对辅助生殖技术生化妊娠成功率的预测表5：基于宫颈阴道分型对辅助生殖技术生临床娠成功率的预测以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。