新型(r)－2－羟基－3－苯基丙酸(d－苯基乳酸)脱氢酶及其编码基因的制作方法

专利名称:新型(r)－2－羟基－3－苯基丙酸(d－苯基乳酸)脱氢酶及其编码基因的制作方法
发明背景已知由微生物产生的某些种类的酶特异性产生具旋光性化合物，例如D-乳酸(Taguchi，H.等，J.Biol.Chem.，266，12588(1991))。此外，已有许多关于用某些种类的酶或产生有用的酶的微生物生产工业用化合物(例如(R)-2-羟基-4-苯基丁酸)方法的报道(日本专利号2750017，日本专利号2752754，日本专利号2774341，日本专利号2873236，日本专利公告号61271/1994，日本专利公开号197774/1994，和日本专利公开号75797/1998)。酶促反应的特征在于其比化学合成产生选择性和有效性更高的目标化合物。另一方面，因为每一种酶的底物特异性严格，所以必需寻找特异性作用于目标化合物的酶。迄今为止，没有报道过特异性针对微生物产生的D-苯基乳酸的脱氢酶。
发明概述本发明者已成功分离出一种特异性还原苯基丙酮酸并产生D-苯基乳酸的酶(即D-苯基乳酸脱氢酶(D-PLDH)和编码该酶的基因。此外，本发明者已成功在大肠杆菌(Escherichiacoli)中大量表达该基因。
本发明的目的之一是提供一种D-苯基乳酸脱氢酶。
本发明的另一目的是提供编码该D-苯基乳酸脱氢酶的基因。
本发明再一目的是提供用于表达D-苯基乳酸脱氢酶的重组载体和转化体，以及一种生产D-苯基乳酸脱氢酶的方法。
本发明的再一个目的是提供PF1022物质和其衍生物的大规模生产体系及其生产方法。
本发明的D-苯基乳酸脱氢酶是一种包含选自下列序列的氨基酸序列的蛋白质(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列，和(b)SEQ ID NO2氨基酸序列的修饰氨基酸序列，它具有选自替换、缺失、添加和插入的一种或多种修饰，并具有D-苯基乳酸脱氢酶活性。
本发明的D-苯基乳酸脱氢酶基因包含编码所述D-苯基乳酸脱氢酶的核苷酸序列。
此外，本发明的D-苯基乳酸脱氢酶基因包含选自下列序列的核苷酸序列(c)SEQ ID NO1的DNA序列，(d)与SEQ ID NO1的DNA序列具有至少70％同源性的核苷酸序列，并且它编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质，
(e)SEQ ID NO1的DNA序列的修饰DNA序列，它具有选自替换、缺失、添加和插入的一种或多种修饰，并且编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质，(f)与SEQ ID NO1的DNA序列在严格条件下杂交的核苷酸序列，并且它编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质。
本发明的重组载体包含本发明的D-苯基乳酸脱氢酶基因。
本发明的转化体是一种包含本发明重组载体的宿主。
本发明的D-苯基乳酸脱氢酶生产方法包括以下步骤培养本发明的转化体；从培养基中收集所述D-苯基乳酸脱氢酶。
本发明的PF1022物质生产体系是用本发明重组载体转化的产生PF1022物质的微生物。
本发明的PF1022物质生产方法包括以下步骤培养用本发明的重组载体转化的产生PF1022物质的微生物，从培养基中收集所述物质。
附图简述
图1说明质粒pDPLDH-1的构建方法。
发明详述微生物保藏实施例1-1所述PF1022菌株保藏于国际专利生物保藏单位国立高级工业科学技术研究院(Tsukuba Central 6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，保藏日期为1989年1月24日。保藏号为FERM BP-2671。
用实施例3-3所述质粒pDPLDH-1转化的大肠杆菌(DH5α)菌株保藏于国际专利生物保藏单位国立高级工业科学技术研究院，保藏日期为2000年4月12日。保藏号为FERM BP-7545。基因和蛋白质本发明提供一种D-苯基乳酸脱氢酶及其基因。
本发明的酶作用于2-氧代-3-苯基丙酸(下文有时称为“苯基丙酮酸”)并将其还原转变为(R)-2-羟基-3-苯基丙酸。通过预先修饰底物苯基丙酮酸能制备D-苯基乳酸的衍生物或类似物。
D-苯基乳酸衍生物的实例包括对氨基苯基乳酸、对-硝基苯基乳酸和对-羟基苯基乳酸。这样，例如对氨基苯基丙酮酸、对-硝基苯基丙酮酸和对-羟基苯基丙酮酸能用作合成D-苯基乳酸衍生物的底物。
D-苯基乳酸类似物的实例包括用作抗高血压剂原料的(R)-2-羟基-4-苯基丁酸。这样，例如2-氧代-4-苯基丁酸可用作合成D-苯基乳酸类似物的底物。
例如在序列(b)中，修饰数量可以是一至数个，更准确地说可以为1-6个。
例如在序列(e)中，修饰数量可以是1-12个。
在序列(b)和序列(e)中，可引入相同的或不同的多个修饰。
序列(d)与SEQ ID NO1的DNA序列的同源性优选为至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％。
在序列(f)中，术语“严格条件”指在低浓度盐溶液中高温洗涤杂交膜，例如在0.2×SSC浓度(1×SSC15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)的0.1％SDS溶液中于60℃洗涤15分钟。
对于序列(b)，可以测定它是否“具有D-苯基乳酸脱氢酶活性”，例如通过为所述D-苯基乳酸脱氢酶提供一种底物(如苯基丙酮酸)和一种还原型辅酶，即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，使所要测试的蛋白发生反应，然后测量酶反应引起的物理化学变化，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的光密度变化和/或产物(即D-苯基乳酸)的数量变化(参见实施例3)。
对于序列(d)、(e)和(f)，可以测定它们是否“编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质”，例如通过在宿主中表达所测试的核苷酸序列，将产生的蛋白与D-苯基乳酸脱氢酶的底物(如苯基丙酮酸)和一种还原型辅酶(即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH))反应，然后测量酶反应引起的物理化学变化，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的光密度变化和/或产物(即D-苯基乳酸)的数量变化(参见实施例3)。
如果已知本发明所述酶的氨基酸序列，容易测定编码该酶的核苷酸序列，并且可以选择编码SEQ ID NO2所述氨基酸序列的各种核苷酸序列。因此，除SEQ ID NO1的DNA序列的部分或全部外，编码本发明酶的核苷酸序列包括编码同样的氨基酸序列并具有简并密码子的任何DNA序列，还包括上述序列的相应RNA序列。
本发明酶和基因的来源没有特别限制，可使用任何能产生本发明酶的微生物；优选产生PF1022物质的微生物(无孢菌类(Myceliasterilia)，FERM BP-2671)。
可测定本发明酶的N-末端氨基酸序列，例如将该酶进行SDS-聚丙烯酰胺电泳，将所得酶带电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或同类的膜上，然后通过蛋白测序分析对其进行分析。
可测定本发明酶的内部氨基酸序列，例如用蛋白酶或同类的酶部分消化该酶，然后在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行上述步骤和用反向层析的分离步骤。
例如本发明的基因可以如下获得。
从产生PF1022物质的微生物中提取基因组DNA并用合适的限制酶裂解，然后用噬菌体载体构建包含产生PF1022物质的微生物基因组DNA的文库。另外，从产生PF1022物质的微生物中提取总RNA，以寡聚dT作引物通过反转录酶反应制备mRNA相应的cDNA，然后用噬菌体载体构建包含产生PF1022物质的微生物cDNA的文库。
根据D-PLDH N-末端氨基酸序列和内部氨基酸序列合成合适的引物。用这些引物并以来自产生PF1022物质的微生物的基因组DNA或cDNA为模板进行多聚酶链式反应(PCR)，从而扩增了D-PLDH基因的DNA片段。用上述DNA片段作探针筛选基因组文库或cDNA文库。这样，可分离出D-苯基乳酸脱氢酶基因的整个区段或表达必需区段。在测定上述DNA片段的碱基序列后，通过PCR或同类方法将合适的限制酶裂解位点导入翻译起始密码子的上游和翻译终止密码子的下游，获得一个只包含所述D-苯基乳酸脱氢酶基因的基因片段。重组载体本发明提供包含编码D-苯基乳酸脱氢酶的核苷酸序列的重组载体。
构建本发明重组载体的程序和方法可以是在遗传工程领域中常用的任何程序和方法。
本文使用的载体的实例包括能整合到宿主基因组DNA的载体和具有自我复制的自主复制序列的载体(能作为质粒存在于宿主细胞的载体)，例如pUC载体(如pUC18和pUC118)、pBluescript载体(如pBluescript II KS+)和质粒如pBR322。一个或多个拷贝的所述基因可存在于宿主细胞中。
可构建本发明的重组载体，例如使分别在编码D-苯基乳酸脱氢酶的核苷酸序列的上游和下游的启动子和终止子有效连接，然后，如果合适的话，使基因标记和/或其它调节序列有效连接。
通过已知方法来实现将启动子和终止子连接到本发明的基因并将表达单元插入到载体中。
在本发明中使用的启动子和终止子没有特别限制。实例包括糖酵解酶基因的调节序列，如3-磷酸甘油激酶和3-磷酸戊二醛脱氢酶；氨基酸合成酶基因的调节序列，如色氨酸合酶；水解酶基因的调节序列，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶；氧化还原酶基因的调节序列，如硝酸还原酶、乳清酸核苷-5’-磷酸脱氢酶和乙醇脱氢酶；以及来自产生PF1022物质的微生物的基因的调节序列，如WO01/18219A1中所述的Abp1(在产生PF1022物质的微生物中高度表达)。
可通过将本发明的基因与编码另一蛋白翻译区的外源基因连接，以融合蛋白形式表达本发明蛋白。
可将基因标记导入，例如通过PCR方法将合适的限制酶裂解位点导入调节序列，将该序列插入质粒载体，然后连接选择标记基因，如药物抗性基因和/或互补营养要求的基因。
依靠筛选转化体技术可以选择合适的选择标记。例如，可以利用药物抗性基因或互补营养要求的基因。药物抗性基因的实例包括越霉素、苯菌灵、寡霉素、潮霉素、G418、满霉素、phosphinothricin、氨苄青霉素、卡那霉素等的抗性基因。互补营养要求的基因的实例包括argB、pyr4、trpC、TRP1、niaD、LEU2和URA3。转化体和D-苯基乳酸脱氢酶的生产本发明提供一种用上述载体转化的宿主。
用于本发明的宿主没有特别地限制，能用作宿主来进行基因重组的任何微生物都可使用。可以使用的宿主的实例包括各种微生物，即某些细菌或真菌，优选大肠杆菌、乳酸杆菌、放线菌、酵母菌和丝状真菌，更优选产生PF1022物质的丝状真菌，最优选PF1022菌株(无孢菌类(Myceliasterilia)，FERM BP-2671)和其变异体。
用于基因表达的重组载体可通过普通方法导入宿主。导入方法的实例包括电穿孔法、聚乙二醇法、aglobacterium法、锂法和氯化钙法。可以选择适合于每种宿主细胞的方法。当产生PF1022物质的微生物用作宿主时优选聚乙二醇法。
转化体可以按照普通方法通过使用适当选择的培养基、培养条件等来培养。就培养基而言，常规组分可以用作培养基。葡萄糖、蔗糖、淀粉糖浆、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、动物油和植物油等可用作碳源。有机氮或无机氮化合物(例如大豆粉、小麦胚芽、pharma培养物、玉米浆、棉籽残渣、肉汁、多聚蛋白胨、麦芽膏、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠和尿素)可用作氮源。如果需要，可以有效添加钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸、硫酸和其它能产生离子的无机盐(例如氯化钾、碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸锰和硫酸铜)。如果需要，可以加入各种维生素如硫胺素(例如硫胺素盐酸盐)、氨基酸如谷氨酸(例如谷氨酸钠)和天冬酰氨(例如DL-天冬酰氨)、核酸组分如核苷酸以及选择性药物如抗生素。此外，可适当加入有机物质和无机物质，促进微生物的生长并提高本发明酶的产量。
培养可以通过有氧条件下的摇瓶培养法、通气搅动培养法或有氧浸没培养法来完成。具体来说，最优选有氧浸没培养法。有些宿主可以通过厌氧培养法来培养。
例如，培养基pH范围大约为6-8。培养通过有氧条件下的摇瓶培养法或通气搅拌培养法完成。合适的培养温度是15℃-60℃，优选大约20℃-40℃。例如，培养时间为60-240小时，优选大约8-168小时。
当培养基中D-苯基乳酸脱氢酶的数量达到其峰值时培养结束，从培养基中分离D-苯基乳酸脱氢酶并纯化。
可以通过破碎培养的微生物细胞，并用普通纯化方法处理得到的无细胞抽提液，从培养物中分离并纯化本发明的酶。例如经离心或过滤培养物回收的微生物细胞通过物理方法破碎，例如利用超声波处理、使用海砂或使用研钵和研杵，或使用球磨机、弗氏细胞压原单位器、冷冻压碎机、搅拌机、混合器等磨碎，之后通过离心去除碎片获得无细胞抽提液。如果经离心或过滤从培养物中回收的细胞不用立即破碎，可通过冷冻或冻干法贮藏它们并当需要时破碎。然后，可以通过使用普通纯化方法(例如硫酸铵分离法、离子交换层析法、亲和层析法、吸附层析法和凝胶过滤法)单一或联合处理无细胞抽提液获得具有活性的酶。
本发明提供了D-苯基乳酸脱氢酶的大规模生产体系。用于D-苯基乳酸脱氢酶的大规模生产体系的宿主实例包括大肠杆菌、乳酸菌、放线菌类、酵母菌和丝状真菌。
本发明的酶将苯基丙酮酸转变为D-苯基乳酸。另一方面，PF1022物质由4分子L-亮氨酸、2分子D-乳酸和2分子D-苯基乳酸经环状缩肽合成酶合成。因此，D-苯基乳酸为合成PF1022物质的原料。所以，如果在产生PF1022物质的微生物中大量表达D-苯基乳酸，则可大量生产PF1022物质。因此，本发明提供PF1022物质的大规模生产体系，其特征在于转化所述体系，以便表达本发明的酶。PF1022物质可用作动物驱虫药(Sasaki，T.等，J.Antibiotics，45，692(1992))。
可用于PF1022物质大规模生产体系的产生PF1022物质的微生物优选为产生PF1022物质的丝状真菌，最优选产生PF1022物质的无孢菌类菌株(FERM BP-2671)。
可用非本发明酶基因的基因进一步转化产生PF1022物质的微生物。例如，通过导入在合成PF1022物质的方案中起作用的酶基因(有时连同强启动子一起)可提高PF1022物质的产量。这种基因的一个实例为环状缩肽合成酶(WO01/18179A1)。
在不合成本发明酶作用底物(即苯基丙酮酸、其衍生物或类似物)的宿主中，可以通过添加缺乏的底物、底物衍生物或类似物到培养基中或通过用编码缺乏的底物、底物衍生物或类似物的基因转化宿主来制备D-苯基乳酸、其衍生物或类似物。这种酶基因的一个实例为涉及从分支酸到对氨基苯基丙酮酸的生物合成途径的基因(WO01/23542A1)。
在所述基因涉及从分支酸到对氨基苯基丙酮酸的生物合成途径的宿主中，合成对氨基苯基丙酮酸，然后本发明的酶将对氨基苯基丙酮酸转变为对氨基苯基乳酸。结果，转变的对氨基苯基乳酸成为生产PF1022物质的原料，因此合成了用氨基在对位修饰苯环的PF1022物质衍生物(即[环(D-乳酰基-L-N-甲基亮氨酰-D-3-(4-氨基苯基)乳酰基-L-N-甲基亮氨酰-D-乳酰基-L-N-甲基亮氨酰-D-3-苯基乳酰基-L-N-甲基亮氨酰)])。用官能团(如氢基)修饰的PF1022物质衍生物可用作合成高活性PF1022物质衍生物的原料。
用于转化的重组载体优选表达载体，其中在产生PF1022物质的微生物中起作用的调节序列(例如启动子和终止子)与本发明的酶基因有效连接，最优选在PF1022菌株(无孢菌类(Myceliasterilia)，FERMBP-2671)中起作用的调节序列与本发明的酶基因有效连接的表达载体。增强表达的强启动子的一个实例是Abp1启动子(WO01/18219A1)。
实施例下列实施例是进一步说明本发明，而不是限制本发明。实施例1D-PLDH的分离和纯化1.微生物细胞的制备产生PF1022物质的微生物(无孢菌类(Myceliasterilia)，FERMBP-2671)进行紫外线照射或经NTG处理诱导突变，得到PF1022产率提高的产生PF1022物质的菌株432-26，将其接种到一个合适容器的50ml种子培养基中[1％酵母提取物，1％麦芽膏，2％聚胨，2.5％葡萄糖，0.1％磷酸氢二钾，0.05％硫酸镁(pH7.0)](WO 01/18179A1)，并在26℃震荡培养3天制备原代种子培养物。在WO 97/20945中描述的500ml培养基的合适容器中接种该培养液，用旋转震荡器在26℃培养3天制备第二代种子培养液。该培养液接种入装有500ml同样培养基的合适容器中并用旋转震荡器在26℃培养4-6天。培养后，所得培养物用商品尼龙布和布氏漏斗抽吸过滤，同时用去离子水洗涤微生物细胞。如此获得的微生物细胞滤饼立即置于-80℃冷冻并于冻干机中干燥两夜。这样制备的冻干细胞可于密封容器中-80℃储存。2.D-PLDH的提取和纯化2μl 0.1M苯基丙酮酸、2μl 0.1M NADPH、缓冲液A(10mM Tris-HCl、10mM DTT、pH8)和使总体积为100μl的任选体积酶样品溶液的混合物于26℃反应2小时。加热处理终止该反应后，用高效液相色谱(柱L-柱ODS 4.6×150mm(Chemicals Evaluation and ResearchInstitute，Japan)，流动相等度0.1M硫酸钠∶乙腈(3.9∶1)，流速1ml/min，温度40℃，紫外检测210nm)分析该反应溶液，以产生的苯基乳酸的数量表示这种酶的活性。此外，用另一高效液相色谱(柱CHIRALPAK WH 0.46×25cm(Daicel Chemical Industries，Ltd.)，流动相25mM硫酸铜水溶液，流速1ml/min，温度40℃，紫外检测210nm)分析所述酶反应产物的光学活性。
下列步骤都在4℃完成。实施例1-1得到的大约70g冻干细胞在球磨机中破碎过夜(罐外径210mm，球直径35mm、TokyoGarasu Kikai Co.，Ltd.)。加入1.5L抽提缓冲液(50mM Tris-HCl、10mMDTT、50mM氯化钾、pH8)到细胞中，充分悬浮得到的精细细胞粉末。用磁力搅拌器温和地搅拌细胞悬浮液1小时。接着将细胞悬浮液用高速冷冻离心机SCR20B(转子NO.RPR9，Hitachi Koki Co.，Ltd.)于8000rpm离心30分钟回收大约1.2L上清液。将回收的上清液上样到Red Sepharose CL6B(Amersham Pharmacia)作载体填充的柱子上(26×300mm)。用缓冲液A冲洗该柱直到未吸附组分彻底消失，之后分级分离出用含1M氯化钾缓冲液A洗脱的蛋白。收集的活性部分用Superdex 200(Amersham Pharmacia)作载体填充的柱子(26×950mm)进行凝胶层析。活性部分立即上样到MonoQ10/10(AmershamPharmacia)。用缓冲液A冲洗该柱后，用0-0.3M氯化钾梯度洗脱吸附蛋白。最终收集的活性组分用缓冲液A稀释10倍并上样到用AMP琼脂糖(Amersham Pharmacia)填充的柱子(16×100mm)。回收未吸附部分并立即上样到用羟磷灰石填充的柱子(5×50mm)。回收未吸附部分并再吸附到MonoQ10/10上。用0-0.2M氯化钾梯度洗脱蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，活性部分所含几乎为分子量约38kDa的单一蛋白质。3.D-PLDH内部氨基酸序列的测定浓缩实施例1-2得到的蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并电迁移至PVDF膜上。用考马斯亮蓝将迁移到PVDF膜上的蛋白染色以确认其存在和位置。将一块带有蛋白的PVDF膜切下并用蛋白测序仪分析N-末端氨基酸序列，然而结果失败。
浓缩实施例1-2得到的蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并用考马斯亮蓝将该凝胶染色。将带有目标蛋白的一块凝胶切下。在一个小试管中用200μl脱色溶液(0.2M碳酸氢铵、50％乙腈、pH8.0)反复洗涤这块凝胶直到将考马斯亮蓝洗净，之后将凝胶减压干燥。在半干的凝胶上加入5μl缓冲液B(0.2M碳酸氢铵、0.02％Tween 20、pH8.0)，然后加入1/100摩尔体积的胰蛋白酶。让混合物静置大约10分钟使酶分散到凝胶中，之后加入200μl缓冲液B，然后蛋白于37℃经酶消化48小时。用三氟醋酸终止该酶反应并回收反应液。用200μl洗液(0.1％三氟醋酸、60％乙腈)彻底洗涤该凝胶，然后将洗液与先前回收的反应液混合。重复洗涤两次回收胰蛋白酶消化液。将回收的胰蛋白酶消化液减压干燥，之后加入60μl蒸馏水获得胰蛋白酶消化的肽片段样品。这个样品用172μ型制备型高效液相色谱系统(Perkin-Elmer Applied Biosystem)经层析分级分离(柱C18，0.21×220mm，梯度0.1％三氟醋酸、5％乙腈-0.085％三氟醋酸、35％乙腈)。在获得的肽片段峰中，分析了两个峰的氨基酸序列并测定出下列序列。肽片段1ANVAGFVTTSEPK(SEQ ID NO3)肽片段2AGDWVTK(SEQ ID NO4)实施例2D-PLDH cDNA的分离1.cDNA分离和cDNA文库构建产生PF1022物质的微生物(无孢菌类(Myceliasterilia)，FERMBP-2671)受到紫外线照射或经NTG处理诱导突变，将得到的产生PF1022物质的菌株432-26(提高了PF1022生产力的菌株)接种到10ml种子培养基[1％酵母提取物、1％麦芽膏、2％聚胨、2.5％葡萄糖、0.1％磷酸氢二钾、0.05％硫酸镁(pH7.0)](WO01/18179A1)的试管中，并于26℃摇动孵育3天。将该种子培养物接种到50ml WO97/20945所述培养基的合适容器中并用旋转震荡器于26℃孵育6天。之后离心回收细胞。用液氮冷冻如此获得的细胞，然后用研钵和研杵破碎。按照说明书用ISOGEN(Nippon Gene)从破碎细胞中分离总RNA。此外，按照说明书用mRNA提纯试剂盒(Amersham Pharmacia)从总RNA提取mRNA。
按照说明书用cDNA快速合成试剂盒(Amersham Pharmacia)由这样获得的mRNA合成cDNA。将该cDNA插入到噬菌体载体λZAPII(Stratagene Co.)中。如此构建的重组噬菌体载体按照说明书用Gigapack III Gold Packaging Extract(Stratagene Co.)体外包装。此后，用这个重组噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue MRF′菌株并在平皿上培养产生噬菌斑。如此构建的cDNA文库有6.8×105个噬菌斑形成单位。此外，按照λZAPII的说明书扩增这个cDNA文库。用这个扩增cDNA文库的重组噬菌体感染大肠杆菌XL1-Blue MRF′菌株并在平皿上培养产生噬菌斑。2.D-PLDH基因的部分DNA片段的分离根据实施例1-3获得的肽片段1和2的序列合成下列两个引物。
引物15′-GTIGTIACRAAICCNGCNAC-3′(SEQ ID NO5)引物25′-GCIGGIGAYTGGGTNAC-3′(SEQ ID NO6)用从产生PF1022物质的微生物(FERM BP-2671)分离的基因组DNA作模板，用这些引物依据WO01/18179A1所述方法进行PCR。用80ng基因组DNA作模板，加入2.5单位的ExTaq DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)、配备的缓冲液和dNTP混合物以及最后浓度分别为0.5μM的两种引物，在100μl反应液中于下列条件下进行PCR94℃5分钟、[94℃1分钟、58℃1分钟、72℃30秒]×40循环、72℃7分钟；4℃贮藏。该反应液经2％琼脂糖凝胶电泳分析显示，扩增出大约550bp的DNA片段。用商品Sephaglas BandPrep试剂盒(Amersham Pharmacia)从琼脂糖凝胶回收该DNA片段。按照说明书用DNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo Co.，Ltd.)连接该回收DNA片段和pT7Blue T-载体(Novagen，Inc.)。
按照说明书用DNA测序试剂盒dRhodamine Terminator CycleSequencing Ready Reaction(Perkin-Elmer)和ABI PRISM 310基因分析仪(Perkin-Elmer)测定如此克隆的DNA片段的碱基序列。结果显示分离DNA片段的碱基序列与D-α-酮酸特异性脱氢酶基因的碱基序列是同源的，明显提示分离DNA片段的碱基序列是目标D-PLDH基因的一部分。3.D-PLDH cDNA整个区段的克隆根据实施例2-2获得的DNA片段的序列重新合成下列两条引物。引物35′-AAGGGATCCCAGCAGAGCACGATGAA-3′(SEQ ID NO7)引物45′-GCAGGCTCGGCTGTAGTTATCAAA-3′(SEQ ID NO8)在cDNA文库的筛选中用PCR产物(用实施例2-2获得的DNA片段作模板，用引物3和引物4经PCR扩增的产物)作探针。用500ngpT8Blue质粒载体(插入了实施例2-2获得的DNA片段的载体)作模板，加入2.5单位的ExTaq DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)、配备的缓冲液和dNTP混合物以及最后浓度分别为0.5μM的两种引物，在100μl反应液中于下列条件下进行PCR94℃5分钟、[94℃1分钟、60℃1分钟、72℃30秒]×40循环、72℃7分钟；4℃贮藏。得到的反应液经2％琼脂糖凝胶电泳，确定存在大约530bp的DNA片段。用Sephaglas BandPrep试剂盒(Amersham Pharmacia)从琼脂糖凝胶回收这个DNA片段。回收的DNA片段按照说明书用ECL Direct DNA/RNA标记检测系统(Amersham Pharmacia)标记，并用作杂交核酸探针。
将印迹膜Hibond N+(Amersham Pharmacia)置于实施例2-1制备的形成噬菌斑的平皿上，拷贝噬菌斑。按照Makabe(KazuhiroMakabe，Visual Experimental Note Series，Biotechnology ExperimentsIllustrated 4，载于Cell Technology增刊，125-133，1977，Shujunsha出版)的方法处理这块膜，将DNA固定到该膜上。在这个处理中用5×SSC洗涤该膜。按照说明书用ECL Direct DNA/RNA标记检测系统(Amersham Pharmacia)将标记核酸探针和固定到膜上的噬菌体DNA杂交，然后检测出杂交了标记核酸的噬菌斑。这样，筛选出包含与探针同源的5′上游区和3′下游区的阳性噬菌体。
按照λZAP II(Stratagene Co.)说明书处理该阳性噬菌体，制备插入了D-PLDH cDNA基因的质粒。4.碱基序列的测定用插入了这样分离出的D-PLDH cDNA基因的质粒作模板，以引物55′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′(SEQ ID NO9)和/或引物65′-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3′(SEQ ID NO10)作引物进行测序。按照说明书用DNA测序试剂盒dRhodamine TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction(Perkin-Elmer)和ABI PRISM 310基因分析仪(Perkin-Elmer)进行测序。从获得的结果，碱基序列未知的区域进一步用根据已测序的碱基序列重新设计的引物测序。这样，测定出插入到质粒的D-PLDH cDNA基因1509-bp的碱基序列。
这个序列的分析显示，存在1011-bp的开放阅读框(ORF)。从这个ORF推知该蛋白具有336个氨基酸残基和36.5kDa的分子量，并且与D-乳酸脱氢酶或类似物是同源的。显示与甘油酸脱氢酶有最高同源性，同源性为37％。如此分离的本发明D-PLDH基因ORF的碱基序列和氨基酸序列分别在序列表中表示为SEQ ID NO1和SEQ IDNO2。实施例3经D-PLDH基因大量表达大规模生产D-PLDH1.用于基因表达的D-PLDH基因的制备用实施例2-3制备的质粒作模板，在5′末端添加Hind III位点，其后为终止密码子，再后为核糖体结合位点的引物75′-AAGCTTGTAAGGAGATATACATGGCCCAAGCACAACCA-3′(SEQID NO11)，以及仅在5′端加入Hind III位点的引物85′-ATGCAAGCTTTAGTGAACCCTATACTTGG-3′(SEQ ID NO12)，进行PCR以便扩增将Hind III位点导入两个末端的D-PLDH基因。用80ng质粒DNA作模板，1单位的TaKaRa LA-Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)、配备的缓冲液和dNTP混合物、25mM氯化镁以及100pM引物，在20μl反应液中于下列条件下进行PCR94℃1分钟、(98℃15秒、68℃3分钟)×30循环、72℃10分钟。得到的反应液经2％琼脂糖凝胶电泳，确定存在大约1000-bp的DNA片段，用Sephaglas Band Prep试剂盒(Amersham Pharmacia)从琼脂糖凝胶回收这个DNA片段。按照说明书用DNA连接试剂盒2型(TakaraShuzo Co.，Ltd.)连接回收的PCR产物和pT7Blue T-载体(Novagen，Inc.)。与D-PLDH连接的质粒导入大肠杆菌DH5α并扩增，用Concert快速质粒纯化系统(Gibco BRL Products)回收质粒DNA。
用来自于实施例2-4的D-PLDH基因的引物和来自PT7质粒载体碱基序列的引物确定这样扩增的D-PLDH的基因序列。按照说明书用DNA测序试剂盒BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction(Perkin-Elmer)和ABI PRISM 310基因分析仪(Perkin-Elmer)进行测序。
在确定该序列之后，将24μl含有连接了大约12μg D-PLDH基因的pT7质粒载体的DNA溶液、3μl Hind III(Toyobo Co.，Ltd.)和3μl配备缓冲液充分混合，将混合物在37℃反应18小时。接下来，反应液经1％琼脂糖凝胶电泳确定大约1000-bp的DNA片段。用SephaglasBand Prep试剂盒(Amersham Pharmacia)从琼脂糖凝胶回收这个DNA片段，获得用于表达的D-PLDH基因。2.基因表达载体的构建将含有约2.5μg商品pUC119(Takara Shuzo Co.，Ltd.)的溶液与Hind III(Toyobo Co.，Ltd.)和配备缓冲液在37℃反应18小时，之后用苯酚抽提回收DNA。加入3μl碱性磷酸酶C75(Takara Shuzo Co.，Ltd.)、3μl配备缓冲液和24μl无菌水，然后将混合物在50℃反应30分钟，以便除去末端磷酸。用苯酚抽提回收脱磷酸DNA并将其溶于3μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8)。按照说明书用DNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo Co.，Ltd)连接5μl实施例3-1制备的用于表达的D-PLDH基因和0.5μl用Hind III消化并末端脱磷酸的pUC119载体，从而构建质粒pDPLDH-1(图1)。3.D-PLDH在大肠杆菌中的表达将导入pDPLDH-1的大肠杆菌DH5α(Toyobo Co.，Ltd.)细胞涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。37℃静止培养18小时后，将生长的大肠杆菌DH5α细胞接种到2ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养18小时制备种子培养物。将种子液的一部分接种到每支2ml同样培养基的10支试管中。在37℃开始振荡培养，5小时后加入最终浓度为1mM的IPTG，继续进一步振荡培养2小时。培养后离心回收细胞，用实施例1-2所述的缓冲液A洗涤细胞，然后将细胞悬浮于2.5ml的缓冲液A中。在冰冷条件下用超声仪处理所得悬浮液，离心除去细胞碎片，这样获得上清液，即粗酶液。用无D-PLDH基因的pUC119转化的大肠杆菌DH5α作对照。
将包含250μM NADPH和250μM苯基丙酮酸的缓冲液A的150μl部分分配到96孔微量滴定板孔中，用移液管每个孔加入50μl粗酶液并立即混合，在26℃340nm测量吸光度的变化。用AbsorptionMicroassay Reader BioLumin 960(Molecular Dynamics)进行测量，追踪反应开始后随着时间的吸光度减少。将每分钟氧化1μmol NADPH的酶量定为1个单位。表1列出了粗酶液酶活性的结果。表1粗酶液中的脱氢酶活性制备粗酶液的菌株 酶活性携带pUC119的菌株 7.30×10-3携带pDPLDH-1的菌株 1.01×10-1已将列出的数值转换为[单位/毫升粗酶液]。
因此，用pDPLDH-1转化的大肠杆菌DH5α显示，D-PLDH活性比用pUC119转化的大肠杆菌DH5α高约13倍。用光学分度柱(optical dividing column)的分析结果证实，携带D-PLDH基因菌株的产物是D-苯基乳酸。证实本发明的基因是D-PLDH基因。
此外，用Mono Q10/10在实施例1-2所述的条件下处理获得的粗酶液，制备部分纯化的酶溶液。将部分纯化的酶溶液加到含有不同浓度底物(苯基丙酮酸)的96孔微量滴定板中测量酶活性。此外，还用替换底物丙酮酸代替苯基丙酮酸测量酶活性。表2列出了测量结果(丙酮酸的反应速度定为100)。表2不同反应底物的相对酶活性反应底物 相对反应速度(苯基丙酮酸的速度＝100)苯基丙酮酸 100丙酮酸 10因此，证明本发明酶明显不同于已知的乳酸脱氢酶或类似物的特征(日本专利号2750017；Taguchi，H.等，J.Biol.Chem.，266，p.12588(1991))，并且就氨基酸序列和酶特性而论该酶是新的酶。
序列表序列表<110>Meiji Seika Kaisha Ltd.<120>新型(R)-2-羟基-3-苯基丙酸(D-苯基乳酸)脱氢酶及其编码基因<130>130899PX<140><141><150>JP 125449/2000<151>2000-04-26<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1011<212>DNA<213>无孢菌类(Mycelia sterilia)<220><221>CDS<222>(1)..(1008)<400>1atg gcc caa gca caa cca cag acc cat tgg gtt att gtc gca ttg gag 48Met Ala Gln Ala Gln Pro Gln Thr His Trp Val Ile Val Ala Leu Glu1 5 10 15act ttc ttc tgt ccg ctc ccc gat ttc act ctc ccg gcg ccg cat acc 96Thr Phe Phe Cys Pro Leu Pro Asp Phe Thr Leu Pro Ala Pro His Thr20 25 30tgc gag ttc cgg aac tat gat cgg acg agg cca gac caa ata gcc gag 144Cys Glu Phe Arg Asn Tyr Asp Arg Thr Arg Pro Asp Gln Ile Ala Glu35 40 45cga att cgt gat gcc gac atc gtg atc atg aca atc ttg ccg atg ccg 192Arg Ile Arg Asp Ala Asp Ile Val Ile Met Thr Ile Leu Pro Met Pro50 55 60gcg gat gtt ctg agc gcg gag gca agc ccg cgc cta aag atg tta tct 240Ala Asp Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Pro Arg Leu Lys Met Leu Ser65 70 75 80atc att gct tca ggc acg gac acc gta gac ttg gcg acg tgc cgg gct 288Ile Ile Ala Ser Gly Thr Asp Thr Val Asp Leu Ala Thr Cys Arg Ala85 90 95cgg ggg ata gtc gta gcc aac acg ccg cat tgc aat gtc acc acg gtc 336Arg Gly Ile Val Val Ala Asn Thr Pro His Cys Asn Val Thr Thr Val100 105 110acc gag cac gta ttc gcg ctc tat ttt gcg aca cgc cgc tcc ata gtg 384Thr Glu His Val Phe Ala Leu Tyr Phe Ala Thr Arg Arg Ser Ile Val115 120 125gca aca cat ctg ctc acg cgc gcc ggc gac tgg gtc acc aag gga tcc 432Ala Thr His Leu Leu Thr Arg Ala Gly Asp Trp Val Thr Lys Gly Ser130 135 140cag cag agc acg atg aac ggg ccc gac ggg aaa ccg ccg atg aca tgt 480Gln Gln Ser Thr Met Asn Gly Pro Asp Gly Lys Pro Pro Met Thr Cys145 150 155 160cgc gac gag ctc gtc ggc atc atc ggc tac ggc gca ata ggg aag aac 528Arg Asp Glu Leu Val Gly Ile Ile Gly Tyr Gly Ala Ile Gly Lys Asn165 170 175gtc gag aca atg gcc aga tca tta ggc atg aaa acc gtc atc gcc ggg 576Val Glu Thr Met Ala Arg Ser Leu Gly Met Lys Thr Val Ile Ala Gly180 185 190cac aag ggg gct gcc tcg acg cca gag ggc cgc gcc cca ttc gag acc 624His Lys Gly Ala Ala Ser Thr Pro Glu Gly Arg Ala Pro Phe Glu Thr195 200 205gtc atc cgc gag gcc tcg gtc gtc gtg gtc tgt ctc cca cgc tcg ccc 672Val Ile Arg Glu Ala Ser Val Val Val Val Cys Leu Pro Arg Ser Pro210 215 220gag aca ttc aac ctc ata tcg gac gct gag ttc gac cag atg aga cag 720Glu Thr Phe Asn Leu Ile Ser Asp Ala Glu Phe Asp Gln Met Arg Gln225 230 235 240tgc ggc ctg ctg atc aac gtg tcg cgc ggc ggc atc gtg gac gag aag 768Cys Gly Leu Leu Ile Asn Val Ser Arg Gly Gly Ile Val Asp Glu Lys245 250 255gcc ctc gtc gct gcg ctg agg gag ggc aag atc gcc ggc gcc ggc aca 816Ala Leu Val Ala Ala Leu Arg Glu Gly Lys Ile Ala Gly Ala Gly Thr
260 265 270gat gta tac tcc cag gaa ccg gcc gag ccg aat aac aac gtc ctg ctc 864Asp Val Tyr Ser Gln Glu Pro Ala Glu Pro Asn Asn Asn Val Leu Leu275 280 285gcc gcg gac acg gcg gac ctc aat ctc gtc acg acg ccg cat ctg gcc 912Ala Ala Asp Thr Ala Asp Leu Asn Leu Val Thr Thr Pro His Leu Ala290 295 300tgg tac gcg gag gag acg ttt gat aac tac agc cga gcc tgc agg gcg 960Trp Tyr Ala Glu Glu Thr Phe Asp Asn Tyr Ser Arg Ala Cys Arg Ala305 310 315 320aac gtc gcc ggc ttc gtc acg aca tcg gaa ccc aag tat agg gtt cac 1008Asn Val Ala Gly Phe Val Thr Thr Ser Glu Pro Lys Tyr Arg Val His325 330 335taa 1011<210>2<211>336<212>PRT<213>无孢菌类(Mycelia sterilia)<400>2Met Ala Gln Ala Gln Pro Gln Thr His Trp Val Ile Val Ala Leu Glu1 5 10 15Thr Phe Phe Cys Pro Leu Pro Asp Phe Thr Leu Pro Ala Pro His Thr20 25 30Cys Glu Phe Arg Asn Tyr Asp Arg Thr Arg Pro Asp Gln Ile Ala Glu35 40 45Arg Ile Arg Asp Ala Asp Ile Val Ile Met Thr Ile Leu Pro Met Pro50 55 60Ala Asp Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Pro Arg Leu Lys Met Leu Ser65 70 75 80Ile Ile Ala Ser Gly Thr Asp Thr Val Asp Leu Ala Thr Cys Arg Ala85 90 95Arg Gly Ile Val Val Ala Asn Thr Pro His Cys Asn Val Thr Thr Val100 105 110Thr Glu His Val Phe Ala Leu Tyr Phe Ala Thr Arg Arg Ser Ile Val115 120 125Ala Thr His Leu Leu Thr Arg Ala Gly Asp Trp Val Thr Lys Gly Ser130 135 140Gln Gln Ser Thr Met Asn Gly Pro Asp Gly Lys Pro Pro Met Thr Cys145 150 155 160Arg Asp Glu Leu Val Gly Ile Ile Gly Tyr Gly Ala Ile Gly Lys Asn165 170 175Val Glu Thr Met Ala Arg Ser Leu Gly Met Lys Thr Val Ile Ala Gly180 185 190His Lys Gly Ala Ala Ser Thr Pro Glu Gly Arg Ala Pro Phe Glu Thr195 200 205Val Ile Arg Glu Ala Ser Val Val Val Val Cys Leu Pro Arg Ser Pro210 215 220Glu Thr Phe Asn Leu Ile Ser Asp Ala Glu Phe Asp Gln Met Arg Gln225 230 235 240Cys Gly Leu Leu Ile Asn Val Ser Arg Gly Gly Ile Val Asp Glu Lys245 250 255Ala Leu Val Ala Ala Leu Arg Glu Gly Lys Ile Ala Gly Ala Gly Thr260 265 270Asp Val Tyr Ser Gln Glu Pro Ala Glu Pro Asn Asn Asn Val Leu Leu275 280 285Ala Ala Asp Thr Ala Asp Leu Asn Leu Val Thr Thr Pro His Leu Ala290 295 300Trp Tyr Ala Glu Glu Thr Phe Asp Asn Tyr Ser Arg Ala Cys Arg Ala305 310 315 320Asn Val Ala Gly Phe Val Thr Thr Ser Glu Pro Lys Tyr Arg Val His325 330 335<210>3<211>13<212>PRT<213>无孢菌类(Mycelia sterilia)<400>3Ala Asn Val Ala Gly Phe Val Thr Thr Ser Glu Pro Lys1 5 10<210>4<211>7<212>PRT<213>无孢菌类(Mycelia sterilia)<400>4Ala Gly Asp Trp Val Thr Lys1 5<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物1<400>5gtngtnacra anccngcnac 20<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物2<400>6gcnggngayt gggtnac 17<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物3<400>7aagggatccc agcagagcac gatgaa 26<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物4<400>8gcaggctcgg ctgtagttat caaa 24<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物5<400>9taatacgact cactataggg 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物6<400>10aattaaccct cactaaaggg 20<210>11<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物7<400>11aagcttgtaa ggagatatac atggcccaag cacaacca 38<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物8<400>12atgcaagctt tagtgaaccc tatacttgg 29
权利要求
1.一种蛋白质，它包含选自下列序列的氨基酸序列(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列，(b)SEQ ID NO2氨基酸序列的修饰氨基酸序列，它具有选自取代、缺失、添加和插入的一个或多个修饰并且具有D-苯基乳酸脱氢酶活性。
2.一种多核苷酸，它编码权利要求
1的蛋白质。
3.权利要求
2的多核苷酸，它包含SEQ ID NO1的DNA序列。
4.一种多核苷酸序列，它选自下列序列(c)SEQ ID NO1的DNA序列，(d)与SEQ ID NO1的DNA序列的同源性至少为70％并且编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质的核苷酸序列，(e)SEQ ID NO1的DNA序列的修饰DNA序列，它具有选自取代、缺失、添加和插入的一个或多个修饰并且编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质，(f)在严格条件下与SEQ ID NO1的DNA序列杂交并且编码具有D-苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质核苷酸序列。
5.权利要求
4的多核苷酸，其中(d)是与SEQ ID NO1的DNA序列的同源性至少为80％的多核苷酸。
6.权利要求
4的多核苷酸，其中(d)是与SEQ ID NO1的DNA序列的同源性至少为90％的多核苷酸。
7.一种重组载体，它包含权利要求
2-6任一项的多核苷酸。
8.一种宿主，它包含权利要求
7的重组载体。
9.权利要求
8的宿主，它表达D-苯基乳酸脱氢酶。
10.权利要求
8或9的宿主，它是产生PF1022物质的微生物。
11.一种生产D-苯基乳酸脱氢酶方法，该方法包括以下步骤培养权利要求
8、9或10的宿主；从所述培养基中收集D-苯基乳酸脱氢酶。
12.一种生产D-苯基乳酸、其衍生物或其类似物方法，该方法包括以下步骤使苯基丙酮酸、其衍生物或其同系物与权利要求
1的蛋白质、权利要求
8、9或10的宿主、所述宿主的抽提物、所述宿主的培养物或从所述培养物提纯的酶反应；以及收集D-苯基乳酸、其衍生物或其类似物。
13.一种生产PF1022物质或其衍生物方法，该方法包括以下步骤培养权利要求
10的宿主；从所述培养基收集PF1022物质或其衍生物。
专利摘要
本发明提供的D－苯基乳酸脱氢酶是一种具有SEQ ID NO2提供的氨基酸序列或由选自取代、缺失、添加和插入的一个或多个修饰衍生所述氨基酸序列产生的氨基酸序列并且具有D－苯基乳酸脱氢酶活性的蛋白质。本发明提供一种包含编码D－苯基乳酸脱氢酶的核苷酸序列的基因，所述核苷酸序列例如SEQ ID NO1提供的核苷酸序列。
文档编号C12P7/42GKCN1437651SQ01811647
公开日2003年8月20日 申请日期2001年4月26日
发明者宫本功一, 隅田奈绪美, 御堂直树, 村上健, R·佐彻尔, H·克雷恩考夫 申请人:明治制果株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan