专利名称:一种卷烟烟气总粒相物致突变性的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种卷烟烟气总粒相物致突变性的检测方法，属于烟草及卷烟烟气安 全性评价技术领域：
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背景技术：
Ames试验是一种检测外源化合物短期致DNA突变的实验方法，其基本原理是利用 外源化合物诱导组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌回复突变的特性来检测外源化合物的致突 变能力。它是国际上公认的化学致突变剂检测的常规方法，也是近二十年食品毒理检测以 及环境化学诱变剂检测等的主要方法之一。该试验能灵敏检测出卷烟烟气总粒相物诱发的 潜在遗传危害，并且结果较为可靠，因此成为国内外评价烟草制品毒性的首选方法之一。
目前Ames试验平板掺入法最权威的当属食品毒理检测标准。本发明根据食品毒 理检测标准上的操作步骤以及给定的药品的参数，用于卷烟烟气总粒相物的致突变检测。 食品标准文献[1]中组氨酸浓度为17. 435mg/250ml，顶层培养基数量为2. 0ml，顶层保温温 度45°C。但根据上述反应体系无法检测出卷烟烟气总粒相物的致突变性，其自发回变菌落 数也很少，有时甚至没有。而国外文献[2-4]和专利报道文献[8]的方法却是采用预培养 法，缺点是增加操作步骤，费时间。食品毒理检测标准上阳性物2-氨基芴和叠氮钠浓度分 别为10ug/皿、1. 5ug/皿，对于阳性物来说，使用剂量偏高，对操作人员的安全性风险增高。 食品毒理检测中样品的浓度为0. lug-5mg/皿，一般选4-5个剂量。对于卷烟烟气总粒相物 来说，这个剂量范围不合适，太宽，无法反应出卷烟烟气总粒相物的剂量-反应关系。
重要参考文献
1.中华人民共和国国家标准，食品安全性毒理学评价程序和方法(GB 15193-94)
2. DeMarini D. M. , Genetoxicity of tobacco smoke and tobacco smokeCondensate, Mutation Research, t983,114 59-89
3.DeMarini D. M. ,Mutation spectra of comlex mixtures,Mutation Research, 1998,411 11-18
4. Doolittle, D.J. , C.K.Lee, et al. , Genetic toxicology studies comparing theactivity of sidestream smoke from cigarettes which burn or only heattobacoo, Mutation Research, 1990，240 :59_72
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6.张冬生等人，不同烟具过滤后的烟草凝聚物致突变性比较，卫生研究，1992， 21(5) 240-243
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8.专利一种改进的卷烟烟气冷凝物Ames试验。公开号CN101671735。
发明内容
本发明目的在于克服食品毒理评价标准中Ames试验在检测卷烟烟气总粒相物致 突变性中的不足之处，而提供一种卷烟烟气总粒相物致突变性的检测方法。
本发明在现有技术的经常基础上改进而成。本发明根据影响Ames试验结果的几 个重要因素，结合卷烟烟气总粒相物这个特殊混合物，对组氨酸的浓度、顶层培养基所加的 量以及保持顶层培养基不会凝固的温度进行改进，具体为
a.组氨酸的量为20-25mg/ml、顶层数量为2. 5ml、顶层保温温度43°C ；
b.卷烟烟气总粒相物的致突变性的剂量范围为25-500ug/皿，在这个剂量范围 内，能很好地检测出剂量-反应关系；
c.降低阳性物的剂量，减少保护操作人员的健康风险；TA98菌株阳性物采用2-氨 基芴，剂量低于10ug/皿，为1-lOug/皿；TA100菌株阳性物采用叠氮钠，剂量低于1. 5ug/ 皿，为 0. 15-1. 5ug/ 皿。
本实验室经过改进上述反应体系以后确定了卷烟烟气总粒相物的浓度，根据卷烟 烟气总粒相物的浓度检测致突变性结果见表2。
表1平板掺入法测定阳性物(2-氨基芴和叠氮钠)对TA98和TA100菌株的致突
变性结果
表2 10个不同卷烟烟气总粒相物致突变性结果
本发明方法与现有技术和预培养法相比，优点在于操作步骤简化，缩短试验时 间，效果一致，细菌回复突变明显，烟气总粒相物在25-500ug/皿的剂量范围内，能检测出致突变性，并呈现很好的剂量反应关系。
具体实施方式
1.卷烟烟气总粒相物(TPM)的制备
将卷烟在恒温恒湿箱中平衡48小时，选取重量和吸阻一致的卷烟。按国标方法， 分别在吸烟机上抽吸20支卷烟，剑桥滤片按10mgTPM/ml加入DMS0浸泡，超声波提取20分 钟，最后用滤纸过滤，分装到冻存管中，保存于-70°C超低温冰箱中备用。
2.菌株的鉴定
本实验室菌株鉴定遵照食品毒理检测标准菌株鉴定操作步骤文献[1]，鉴定合格 以后用于实验。菌株采用市场购买的MOLTOX AMES ASSAY STDisc TA98和TA100两种菌株。
3.底层培养基的配制
遵照食品毒理检测标准操作步骤文献[1]配制底层培养基。
4.顶层培养基配制
本方法配制的组氨酸浓度为20-25mg/250ml ；顶层培养基量为2. 5ml。将顶层培养 基分装在10ml小试管中，120°C、20min常规高压灭菌后放入43°C水浴锅中保温。顶层培养 基在43°C水浴中保温不凝固。其它试剂浓度及配制方法同食品毒理检测标准操作步骤文献 [1]。
4.受试物配制
将放置在超低温冰箱中的TPM取出，放置室温使其融化，本实验经过大量样品检 测发现选择了 25、50、75、100、125、250、500呢/皿为检测卷烟烟气总粒相物的最佳剂量。 TPM母液浓度为10mg/ml，7个剂量分别取母液量为2. 5、5. 0、7. 5、10. 0、12. 5、25、50ul/皿， 每个浓度做5个平板。阳性对照，有活化系统时TA98阳性对照为1-lOug/皿2-氨基芴； 无活化系统时TA100阳性对照为0. 15-1. 5ug/皿叠氮钠。阴性对照为溶剂对照(DMS0)，浓 度为50ul/皿。
5.受试物平板掺入
吸取不同体积的受试物与0. lml菌液，加入0.5ml 10% S9混合液；之后，取已灭 菌并在43°C水浴中保温的顶层培养基(2. 5ml)，迅速在涡旋振荡器上混勻，倒入底层平板 培养基上，转动平板使顶层培养基均勻分布在底层上，平放固化，37°C培养48h。
6.计数菌落及数据统计
将平板放在菌落计数仪上进行计数，统计结果，进而评价卷烟烟气总粒相物的致
突变性。
权利要求
一种卷烟烟气总粒相物致突变性的检测方法，在Ames试验平板掺入法基础上改进而成，其特征在于a.组氨酸的量为20-25mg/ml、顶层数量为2.5ml、顶层保温温度43℃；b.卷烟烟气总粒相物的致突变性的剂量范围为25--500ug/皿；c.TA98菌株的阳性物为2-氨基芴，采用的剂量为1-10ug/皿；TA100菌株的阳性物为叠氮钠，采用的剂量为0.15-1.5ug/皿。
专利摘要
本发明涉及一种卷烟烟气总粒相物致突变性的检测方法，属于烟草及卷烟烟气安全性评价技术领域：
。本发明在Ames试验平板掺入法基础上改进而成，其改进点在于a.组氨酸的量为20-25mg/ml、顶层数量为2.5ml、顶层保温温度43℃；b.卷烟烟气总粒相物的致突变性的剂量范围为25-500μg/皿；c.TA98菌株的阳性物为2-氨基芴，采用的剂量为1-10μg/皿；TA100菌株的阳性物为叠氮钠，采用的剂量为0.15-1.5μg/皿。本发明的优点在于操作步骤简化，缩短试验时间，效果一致，细菌回复突变明显，阳性物剂量降低，所选择的烟气总粒相物剂量范围合时，能检测出烟气总粒相物的致突变性。
文档编号C12Q1/02GKCN101851658SQ201010154088
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月23日
发明者倪红梅, 夭建华, 李雪梅, 米其利, 缪明明, 黄海涛 申请人:云南烟草科学研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan