一种从猪肺中提取肝素的生产方法

一种从猪肺中提取肝素的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种从猪肺中提取肝素的生产方法。
【背景技术】
[0002]肝素，是酸性粘多糖硫酸酯类抗凝血药。近年来研宄证明肝素还有降血脂作用，多年来，国际市场对肝素的需求一直十分旺盛。因肝素是从动物内脏中提取加工而得的，产量受到一定限制，时常满足不了市场需求。自20世纪90年代后期开始，全球市场肝素需求大幅增加，我国肝素生产和出口连年均以较大幅度上升，出口量和出口金额呈快速增长态势。中国已成为世界上首屈一指的肝素原料药出口大国。2001年，全国肝素产品出口金额为4460万美元。2002年，出口金额达5894万美元，比上年增长了 32.17 %。肝素产品在我国医药类产品出口金额排序中已跻身前5位，仅次于维生素C、柠檬酸、维生素E和磺胺。
[0003]我国生产的肝素产品除满足国内市场外，还大量出口。长期以来，我国产品出口顺畅，只要质量达到要求，常常有多少就出口多少。与之形成对比的是，由于我国的经济发展状况和人民生活水平的限制，，对这种昂贵(注射用精品8?10美元/mega，口服用为7?8美元/mega)的抗凝血药目前国内消费量极小，主要是创汇，销往日本、美国、欧洲等发达国家和地区。
[0004]目前，国内生产肝素的方法，主要是盐解法和酸解法，比如公开号为CN101735340A、CN101649008A、CN101519459A等等的中国发明申请，这两种方法都是采用猪小肠粘膜为原料，在碱性条件下通过盐解、酶解，出去部分蛋白质后，通过三甲胺季铵性强碱性阳离子交换树脂吸附剂洗脱，在洗脱液中加以乙醇沉淀既得肝素钠初级原料出售，其缺点是生产周期长达48h，反应温度为95-100°C，能源消耗大，水解不完全，收率低，生产I亿国际单位(IU)肝素粗品需2800-3000根猪小肠粘膜，所得产品纯度低，粗品含肝素至多为80效价/毫克；并产生大量的肥肠渣和废水，污染环境；且生产过程中树脂再生困难，这种制备方法由于生产周期长，水解不完全、不彻底，制得的肝素钠纯度低、收率低、效价低，很难进行规模性生产，且不能满足市场的大量需求。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种产品生产周期短、纯度高、效价高、杂质少、绿色环保的利用猪肺提取肝素粗品的生产方法，本工艺采用生物酶解法从原材料易得的猪肺中提取肝素粗品。
[0006]本发明实现目的的技术方案如下:
一种从猪肺中提取肝素的生产方法，其特征在于:步骤如下:(1)预处理:将猪肺清洗，去除内外污物和脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入水搅拌得到猪肺混合液，其中猪肺和水的质量比为1:3-4 ；(2)酶解:调猪肺混合液pH值为6.5?8.0，加入猪肺重量的1.5%?2.5%的硫酸软骨素复合酶，搅拌均匀，升温至30?45°C，保温反应30?60min后，保持反应液的pH值为7.0?7.5，加入猪肺重量的0.25%?0.5%胰蛋白酶，搅拌均匀，保温2?4h，继续升温到90?100°C，保持5?lOmin，冷却，得到猪肺酶解液(3)除蛋白:过滤猪肺酶解液，去除表面油脂层，调滤液pH值为8.5?10.5，搅拌升温到55?65°C时加入猪肺重量的0.1%?0.4%的澄清剂，继续升温至90?95°C，保温反应2?4h，冷却至常温；(4)超滤:将上述液体用0.2?0.4 μπι滤膜进行过滤，得过滤液；(5)氧化沉淀:加入双氧水，使过滤液中双氧水的含量为10?30g/kg，常温反应8?12h过滤，得滤液，将滤液调pH至4.5?5.5，加入等体积的无水乙醇沉淀过夜后，除去上层清液，沉淀物为粗品肝素；
[6]冷冻干燥:将粗品肝素放入真空冷冻干燥箱内，设定温度-20?10°C，真空度0.05?0.08Mpa，干燥时间2?4h。
[0007]所述的一种从猪肺中提取肝素的生产方法，其特征在于:所述步骤(2)硫酸软骨素复合酶为硫酸软骨素酶A、B和C中二种或以上的组合。
[0008]所述的一种从猪肺中提取肝素的生产方法，其特征在于:所述步骤(3)澄清剂为天然1+1澄清剂，使用之前用冰醋酸配成1%的溶液。
[0009]所述的一种从猪肺中提取肝素的生产方法，其特征在于:所述步骤(5)调pH值所用的酸为冰醋酸、草酸、柠檬酸中的一种或者二种混合。
[0010]本发明的优点和有益效果为:1、本发明采用的酶解方法能更彻底全面地溶解猪肺浆液，用胰蛋白酶终止酶解，真空冷冻干燥技术稳定了产品的质量以及提高收率，同时获得的粗品杂质少、效价高；2、本发明生产方法中采用澄清剂来替代乙醇反复醇沉来去除蛋白质的传统工艺，具有去除率高，节约了大量乙醇的使用量，降低了生产成本；3、本发明工艺设计合理，生产无毒、无害、生物绿色环保，猪肺原料来源易得，运营生产成本低，适合大规模工业化生产。
【具体实施方式】
[0011]
实施例1:一种从猪肺中提取肝素的生产方法，其特征在于:步骤如下:(1)预处理:将猪肺5kg清洗，去除内外污物和脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入15kg水搅拌得到猪肺混合液；(2)酶解:用氢氧化钠调猪肺混合液pH值为6.5，加入75g的硫酸软骨素A和C，搅拌均匀，升温至30°C，保温反应30min后，保持反应液的pH值为7.0，加入12.5g胰蛋白酶，搅拌均匀，保温2h，继续升温到90°C，保持5min，冷却，得到猪肺酶解液(3)除蛋白:过滤猪肺酶解液，去除表面油脂层，用氢氧化钠调滤液PH值为8.5，搅拌升温到55°C时加入5g的澄清剂，继续升温至90°C，保温反应2h，冷却至常温；(4)超滤:将上述液体用0.2 μπι滤膜进行过滤，得过滤液；(5)氧化沉淀:加入双氧水，使过滤液中双氧水的含量为ΙΟ/kg,常温反应8h过滤，得滤液，将滤液用冰醋酸调pH至4.5，加入20kg的无水乙醇沉淀过夜后，除去上层清液，沉淀物为粗品肝素；(6)冷冻干燥:将粗品肝素放入真空冷冻干燥箱内，设定温度-20°C，真空度0.05Mpa，干燥时间2h，既得肝素粗品20 g，其效价为每毫克100单位。
[0012]实施例2:—种从猪肺中提取肝素的生产方法，其特征在于:步骤如下:(1)预处理:将10kg猪肺清洗，去除内外污物和脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入350kg水搅拌得到猪肺混合液(2)酶解:用氢氧化钠调猪肺混合液pH值为7.0，加入猪肺重量的2kg的硫酸软骨素A和B，搅拌均匀，升温至40°C，保温反应45min后，保持反应液的pH值为7.0，加入0.3kg胰蛋白酶，搅拌均匀，保温3h，继续升温到95°C，保持7min，冷却，得到猪肺酶解液(3)除蛋白:过滤猪肺酶解液，去除表面油脂层，用氢氧化钠调滤液pH值为9.0，搅拌升温到60°C时加入0.2kg的澄清剂，继续升温至93°C，保温反应3h，冷却至常温；(4)超滤:将上述液体用0.2 μ m滤膜进行过滤，得过滤液；(5)氧化沉淀:加入双氧水，使过滤液中双氧水的含量为20g/kg，常温反应1h过滤，得滤液，将滤液用草酸调pH至5.0，加入350kg无水乙醇沉淀过夜后，除去上层清液，沉淀物为粗品肝素；(6)冷冻干燥:将粗品肝素放入真空冷冻干燥箱内，设定温度-10°C，真空度0.07Mpa，干燥时间3h，既得肝素粗品0.5kg,其效价为每毫克90单位。
[0013]实施例3:—种从猪肺中提取肝素的生产方法，其特征在于:步骤如下:(1)预处理:将100kg猪肺清洗，去除内外污物和脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入4000kg水搅拌得到猪肺混合液(2)酶解:调猪肺混合液pH值为8.0，加入猪肺重量的25kg的硫酸软骨素B和C，搅拌均匀，升温至45°C，保温反应60min后，保持反应液的pH值为7.5，加入5kg胰蛋白酶，搅拌均匀，保温4h，继续升温到100°C，保持lOmin，冷却，得到猪肺酶解液(3)除蛋白:过滤猪肺酶解液，去除表面油脂层，用氢氧化钠调滤液pH值为10.5，搅拌升温到65°C时加入4kg的澄清剂，继续升温至95°C，保温反应4h，冷却至常温；(4)超滤:将上述液体用0.4 μ m滤膜进行过滤，得过滤液；(5)氧化沉淀:加入双氧水，使过滤液中双氧水的含量为30g/kg，常温反应12h过滤，得滤液，将滤液用柠檬酸调pH至5.5，加入4000kg的无水乙醇沉淀过夜后，除去上层清液，沉淀物为粗品肝素；(6)冷冻干燥:将粗品肝素放入真空冷冻干燥箱内，设定温度0°c，真空度0.0SMpa,干燥时间4h，既得肝素粗品4.8kg，其效价为每毫克100单位。
【主权项】
1.一种从猪肺中提取肝素的生产方法，其特征在于:步骤如下:(I)预处理:将猪肺清洗，去除内外污物和脂肪后，绞碎成糜状，并在充分搅拌下，加入水搅拌得到猪肺混合液，其中猪肺和水的质量比为1:3-4 ；(2)酶解:调猪肺混合液pH值为6.5?8.0，加入猪肺重量的1.5%?2.5%的硫酸软骨素复合酶，搅拌均匀，升温至30?45°C，保温反应30?60min后，保持反应液的pH值为7.0?7.5，加入猪肺重量的0.25%?0.5%胰蛋白酶，搅拌均匀，保温2?4h，继续升温到90?100°C，保持5?lOmin，冷却，得到猪肺酶解液(3)除蛋白:过滤猪肺酶解液，去除表面油脂层，调滤液pH值为8.5?10.5，搅拌升温到55?65°C时加入猪肺重量的0.1%?0.4%的澄清剂，继续升温至90?95°C，保温反应2?4h，冷却至常温；(4)超滤:将上述液体用0.2?0.4 μπι滤膜进行过滤，得过滤液；(5)氧化沉淀:加入双氧水，使过滤液中双氧水的含量为10?30g/kg，常温反应8?12h过滤，得滤液，将滤液调pH至4.5?5.5，加入等体积的无水乙醇沉淀过夜后，除去上层清液，沉淀物为粗品肝素；(6)冷冻干燥:将粗品肝素放入真空冷冻干燥箱内，设定温度-20?10°C，真空度0.05?0.08Mpa，干燥时间2?4h。
2.根据权利要求1所述的一种从猪肺中提取肝素的生产方法，其特征在于:所述步骤(2)硫酸软骨素复合酶为硫酸软骨素酶A、B和C中二种或以上的组合。
3.根据权利要求1所述的一种从猪肺中提取肝素的生产方法，其特征在于:所述步骤(3)澄清剂为天然1+1澄清剂，使用之前用冰醋酸配成1%的溶液。
4.根据权利要求1所述的一种从猪肺中提取肝素的生产方法，其特征在于:所述步骤(5)调pH值所用的酸为冰醋酸、草酸、柠檬酸中的一种或者二种混合。
【专利摘要】一种从猪肺中提取肝素的生产方法，步骤如下：将新鲜猪肺绞碎成浆液、浆液保温酶解、酶解液过滤收集滤液、对滤液进行除蛋白处理、超滤、氧化沉淀、冷冻干燥得肝素粗品。本发明的优点和有益效果为：1、本发明采用的酶解方法能更彻底全面地溶解猪肺浆液，用胰蛋白酶终止酶解，真空冷冻干燥技术稳定了产品的质量以及提高收率，同时获得的粗品杂质少、效价高；2、本发明生产方法中采用澄清剂来替代乙醇反复醇沉来去除蛋白质的传统工艺，具有去除率高，节约了大量乙醇的使用量，降低了生产成本；3、本发明工艺设计合理，生产无毒、无害、生物绿色环保，猪肺原料来源易得，运营生产成本低，适合大规模工业化生产。
【IPC分类】C08B37-10
【公开号】CN104530262
【申请号】CN201510036218
【发明人】郭庆, 徐宾朋, 赵厚发
【申请人】安徽科宝生物工程有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月26日