利用猪肺联产高纯度肝素钠和硫酸皮肤素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，涉及肝素钠和硫酸皮肤素的制备方法，具体涉及从猪肺中联产肝素钠和硫酸皮肤素的方法。
【背景技术】
[0002]肝素钠(heparin sodium)是N-硫酸和艾杜糖醒酸含量较多的一种糖胺聚糖。临床上主要用于血管栓塞性疾病、心血管手术、心脏导管检查、体外循环和血液透析等。
[0003]肝素钠广泛存在于哺乳动物肝、肺、肠黏膜中，多与蛋白质结合成复合体存在。酶解蛋白可分离肝素钠，在PH8-9时，带负电荷，可与阴离子交换剂进行离子交换，进行粗分离。粗分离液在高浓度乙醇中沉淀进行精制纯化。
[0004]长期以来，我国肝素钠粗品生产以猪小肠粘膜作为原料，也是商品肝素钠的主要来源。利用猪小肠粘膜生产肝素钠的小型生化厂有近1500家，几乎每县一家，资源已利用怠尽，竞争十分激烈。
[0005]硫酸皮肤素(dermatan sulfate, DS或CSB)也是糖胺聚糖的一种。DS广泛分布于动物组织中，属于硫酸软骨素(CS)的一种，具有抗血栓、抗水肿、促进皮肤更新、阻止皮肤的过度角质化和棘皮症、滋润皮肤和保持水分的作用，可用于降血脂、骨关节疾病治疗以及滴药液。
[0006]传统的硫酸皮肤素来源于动物皮层或牛肺中，特别是水生生物(如鮫錬鱼等)的皮层，通过酶降解和酸碱沉淀的方式得到，最后再通过离子交换层析获得高纯度的硫酸皮肤素。2008年张虹等人(专利申请号200710069959.0)以鮫錬鱼皮为原料进行提取，再通过醇沉冻干后即可得硫酸皮肤素粗品。将粗品溶于水，以氢氧化钠和班式试剂沉淀，将沉淀溶于乙酸中，用氢氧化钠中和后透析，透析液通过强酸型阳离子树脂脱铜，脱铜液以乙酸调至PH4-5，最后以2倍乙醇沉淀出硫酸皮肤素。该法得到的硫酸皮肤素粗品灰色粉末状，纯度为75%。
[0007]2012由守谊等人(专利申请号201210095896.7)以粗品肝素为原料，以粗品肝素钠为原料，采用盐解、酶解工艺进行预处理，依次经离子絮凝、超滤、玻璃粉吸附三种除杂技术，获得260nm光吸收极低的肝素钠中间体。再经氧化、溶剂分级分离，最终得到高纯度的肝素钠精品。
[0008]2009年李坦等人(专利申请号200910039361.6)以肝素副产物为原料，通过酸碱沉淀，再以离子交换吸附，线性梯度洗脱，最后以浓缩醇沉后得到高纯度的硫酸皮肤素，其所得的硫酸皮肤素的HPLC测定纯度，旋光度及抗凝效价的检测均较为理想。
[0009]现有的分离技术中，对肝素钠与类似物质(如硫酸皮肤素)的分离，其不足之处为:耗时耗力，耗费试剂，操作复杂、收率低。
[0010]针对上述资源紧张和分离纯化技术的不足，解决现有方法耗费试剂，耗时耗力，操作复杂等问题，本发明提供的能够快速从猪肺中一步纯化肝素钠和硫酸皮肤素的方法，不仅提高了产品的质量，得到了高纯度的肝素钠，并且充分利用了生产的副产物，得到了高纯度硫酸皮肤素，所得的肝素钠和硫酸皮肤素的纯度均较高，方法绿色无污染，简单易行，适合用于工业的大规模生产。
【发明内容】
[0011]本发明的任务是提供一种从猪肺中提取硫酸皮肤素的方法和一种从猪肺中提取肝素的方法，以改进现有粗品肝素钠的生产工艺，提高肝素钠产品的纯度，以解决目前生产的粗品肝素中含有大量硫酸皮肤素杂质的问题，并获得能用于生产注射级精品肝素钠以及药用级硫酸皮肤素。
[0012]实现本发明的技术方案是:
本发明提供的从猪肺中提取硫酸皮肤素的方法，包括以下步骤:
步骤一取新鲜的猪肺绞碎成猪肺浆料，加入1-2倍重量的去离子水搅拌1-2小时，得肺浆液；
步骤二将步骤一得到的猪肺浆液中加入占总液体重量2.5-3.5%的氯化钠，调pH至10-11，搅拌均匀，在25-30°C下间歇搅拌反应4-8小时，得到猪肺碱解液；
步骤三将步骤二得到的猪肺碱解液缓慢加热至40-45 °C，调pH至8-10，加入占猪肺浆料重量0.05-0.15%的肝素钠复合蛋白酶，搅拌均匀，保温反应2-3小时后，缓慢加温至50-600C，保温反应2-3小时，再加热至80-85°C，保温0.5-1小时得到猪肺酶解液；
步骤四将步骤三所得的酶解液降温至55?57°C后加入树脂，搅拌吸附8小时，用80目尼龙布过滤袋将树脂滤出收集；
步骤五将步骤四中收集的树脂用浓度为2%-5%的氯化钠溶液洗涤30?40分钟，洗去蛋白等杂质；
步骤六将步骤五洗净的树脂用浓度为5%?10%的氯化钠溶液两次洗脱树脂，收集洗脱液A ;最后用浓度为20%-24%的氯化钠溶液三次洗脱树脂，收集洗脱液B ；
步骤七将步骤六获得的洗脱液A以100Da的超滤膜进行超滤，当体积浓缩4.5?5.0倍即可，得浓缩洗脱液Al。
[0013]步骤八将步骤七所得浓缩洗脱液Al中加入分析纯无水乙醇，使乙醇浓度达到40?50%，出现白色沉淀物，通过离心，去除上清，将沉淀在60°C烘箱中放置过夜，获得纯度为90?94%的硫酸皮肤素。
[0014]本发明提供的从猪肺中提取肝素钠的方法是:
先将权利要求1之步骤六获得的洗脱液B，以100Da的超滤膜进行超滤，当体积浓缩4.5?5.0倍即可，得浓缩洗脱液BI ；
再向所得浓缩洗脱液BI中加入分析纯无水乙醇，使乙醇浓度达到40?50%，出现白色沉淀物，通过离心去除上清，将沉淀在60°C烘箱中放置过夜，获得纯度为95?98%的肝素钠。
[0015]本发明以猪肺为原料，通过酶解、离子交换层析、梯度洗脱、超滤浓缩和醇沉最终生产得到高纯度肝素和硫酸皮肤素。对获得的硫酸皮肤素与肝素钠采用常规旋光仪测定其旋光度，采用常规高效液相色谱测定其纯度，采用羊血浆法测定其效价。本发明利用硫酸皮肤素和肝素钠的离子强度差异所导致的与强阴离子树脂的吸附强度的不同，在不同的氯化钠浓度下洗脱使肝素钠与硫酸皮肤素分离，硫酸皮肤素在较低浓度的洗脱下得到充分的分离，肝素钠在第二个梯度的洗脱液浓度下得到充分的分离，洗脱步骤中应严格按照规定浓度的洗脱液进行，否则将影响硫酸皮肤素与肝素的纯度。本发明仍然是采用传统的离子交换层析的方法进行分离，对肝素和硫酸皮肤素的分子结构与性质并没有影响，本发明在维持了当前肝素钠生产工艺的生产成本的基础上，提高了产品的质量，并且充分利用也生产中的副产物，纯化所得到的肝素的效价及分子量测定均符合《中国药典》相关要求。
[0016]本发明与现有公开的中国专利申请号为201210095896.7的技术方案相比，201210095896.7号专利的主要特征是将粗品肝素采用盐解、酶解工艺进行预处理，依次经离子絮凝、超滤、玻璃粉吸附等方法除杂，而本发明与其主要差别在于省去了第二次的重复处理步骤；直接以猪肺为原料进行，而不是以粗品肝素钠为原料；采用现在常用的洗脱方法，使肝素钠纯度得到了提升；同时得到了纯度为90?94%的硫酸皮肤素。本发明不仅简化了肝素钠生产工艺，同时也提高了生产的收益，获得了更大的综合效益。在肝素钠与硫酸皮肤素浓缩阶段引进与应用超滤技术，
可直接扩大到生产规模，提高了生产效率，节约了生产成本。与现有公开的硫酸皮肤素的专利(中国专利申请号200910039361.6)提取方法相比，本发明的优势在于，不是在肝素钠生产工艺之外，专门从从副产物里分离纯化硫酸皮肤素，而是在肝素钠生