高纯度和优异产量的正确折叠的依那西普的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明通常涉及用于纯化重组表达的蛋白质的层析分离方法，和从该方法得到的 产物。更具体地，本发明涉及使用混合模式的层析法以纯化重组蛋白表达产物，包括，例如， 可能包括不期望量的非正确折叠的和/或聚集的蛋白质和适当折叠的蛋白质的融合蛋白。 本发明的混合模式层析方法特别有用于从不正确折叠的依那西普（如本文所定义的）中分 离正确折叠的依那西普。本发明也涉及依那西普制备物和药物制剂，其中已使用本公开的 方法高产率和高纯度地制备供应其中的依那西普。本发明进一步涉及采用高纯度的以非常 低水平的错误折叠的/聚集的蛋白质为特征的依那西普治疗TNF病况的方法。
【背景技术】
[0002] 依那西普（Enbrel?，Immunex Corporation制造）是由与人类免疫球蛋白 G( "IgGl"）的Fc受体[片段，可结晶的]区域连接的人类75千道尔顿（p75)肿瘤坏死因 子受体（"TNFR"）的细胞外配体结合部分组成的二聚融合多肽。依那西普由934个氨基 酸组成并具有约150千道尔顿的表观分子量（Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company, Inc.)。依那西普的Fe成分包含重链恒定结构域2 (CH2)、重链恒定结 构域3 (CH3)和铰链区，但不包括人类IgGl的重链恒定结构域I (CHl)。一个Fc域可包括一 个或所有的上述域。
[0003] 患有一些类型的炎性疾病例如风湿性关节炎、斑块状银肩病、银肩病关节炎、幼年 特发性关节炎和强直性脊柱炎的人具有过度产生肿瘤坏死因子（"TNF"）的免疫系统。已 发现施用依那西普对治疗一些炎性疾病是有效的，因为它可通过作为诱饵受体结合TNF而 降低受试者中活化型TNF的水平。
[0004] 可通过重组DNA技术在中国仓鼠卵巢（"CH0"）的哺乳动物细胞表达系统中以已 知的方式产生依那西普。不幸的是，由CHO细胞产生的产物包含大量的不正确或错误折叠 和/或聚集的依那西普。对于药物应用，需要提供相对没有不正确折叠的和聚集的蛋白质 的依那西普，因为所述不正确折叠的/聚集的蛋白质将不具有与正确折叠的蛋白质相同的 治疗效果，且可能实际上对患者是有害的。
[0005] 错误折叠和聚集经常发生在产生重组蛋白的过程中，并因此必须通过能够从错误 折叠或聚集的蛋白质中分离正确折叠的蛋白质的下游过程进行处理。错误折叠减少或消除 蛋白质的治疗效果。通常被理解为涉及两种或更多种依那西普同源二聚体的非共价联合以 形成非常高分子量物种的聚集导致相似的治疗效果的损失，且当蛋白质（包括错误折叠的 蛋白质）积累并聚在一起时，聚集发生。如上所述，这样的错误折叠的蛋白质和蛋白质聚集 体不仅是治疗无效的，也可能是对患者有害的。相应地，纯化含依那西普的蛋白质表达产物 以使适当折叠的依那西普从错误和/或积聚的依那西普中分离的能力对于得到提供最高 可能程度的药物可接受性的依那西普是重要的。
[0006] 错误折叠和聚集的蛋白质的产生不是特定于依那西普的问题。具有许多治疗性蛋 白质，对其来说错误折叠可能是一个问题。例如，在来自大肠杆菌包涵体的重组蛋白重折叠 的过程中，含二硫化物的蛋白质的错误折叠是难以避免的，但其可通过高分辨率的反相色 谱法而被有效分离。然而，在反相色谱法中低pH和有机溶剂的使用在色谱分析过程中可使 蛋白质变性并可能引起纯化的蛋白质的聚集。
[0007]即使当错误折叠被认为在制备药物蛋白质中是可忽略的时，例如在哺乳 动物分泌性表达的情况下，仍可能发生聚集和一些错误折叠（参见，例如，Chi，E. Y.,Krishnan,S. , Randolph, T. W. and Carpenter, J. F. , Physical Stability of Proteins in Aqueous Solution:Mechanism and Driving Forces in Nonnative Protein Aggregation,Pharm.Res.,20, 1325-1336 (2003) ；Kiese,S.,Pappenber ger,A.,Friess, W. , and Mahler,H. C. , Shaken, Not Stirred:Mechanical Stress Testing of an IgGlAntibodyj J. Pharm. Sci. , 97, 4347-4366 (2008)) 〇 研究者已 在非变性条件下成功分离出非原生的、错误折叠的蛋白质，所述分离使用利用离子 交换的水性色谱分析法（"IEC"）（参见，例如，Gagnon，P. J.，Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography in the Presence of Polyethylene Glycol，Immunol. Methods，336, 222-228 (2008) ;Gagnon，P.，Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Validated Biosystems，Tucson，AZ，57-87(1996) ；Shukla,A. A. , and Yigzaw, Y. , Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry,Shukla,A.,Etzel,M., and Gadam，S.，eds.，179-227, CRC Press, Boca Raton (2007) ；Staby, A. , Jacobsen, J. H. , Hansen, R. G. , Bruus, U. K. , Jensen, I. H., Comparison of Chromatographic Ion-exchange Resins. V. Strong and Weak Cation-Exchange Resins,J.Chromatogr. A, 1118, 168-179(2006) ；ShukIa,A. A. , Hub bard,B. ,Tressel,T. ,Guhan, S. , Low, D. J. , Downstream Processing of Monoclonal Antibodies-Application of Platform Approaches，Chromatogr. B，848,28-39 (2007)； Shihara,T.,Kadoya, T. J. , Accelerated Purification Process Development of Monoclonal Antibodies for Shortening Time to Clinic:Design and Case Study of Chromatography Processes，Chromatogr.A，1176，149-156 (2007) ；Fahrner,R. L. , Knudsen, H. L. , Basey, C. D. , Galan, W. , Feuerhelm, D. , Vanderlaan, M. , Blank, G. S., Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies:Development,Ope ration,and Validation of Chromatography Processes, Biotechnol. Genet. Eng. Rev.，18, 301-27 (2001);和 Yigzaw，Y.，Hinckley，P.，Hewig，A. and Vedantham，G.，Ion Exchange Chromatography of Proteins and Clearance of Aggregates, Curr. Pharm. Biotech.，10, 421-426 (2009))、利用疏水相互作用的水性色谱分析法（"HIC"）（参见， 例 如，Chen，J.，Tetrault，J.，Ley，A.，Comparison of Standard and New Generation Hydrophobic Interaction Chromatography Resins in the Monoclonal Antibody Purification Process,J.Chromatogr.A., 1177,272-81 (2008) ;Gagnon，P.，and Grund，E.，Large Scale Process Development for Hydrophobic Interaction Chromatography, Part 4:Controlling Selectivity,BioPharmj 9, 54-64(1996)； 和 Lu,Y. , Williamson, B. , and Gillespie, R. , Recent Advancement in Application of Hydrophobic Interaction Chromatography for Aggregate Removal in Industrial Purification Process，Curr. Pharm. Biotech.，10, 427-33(2009))和羟基磷灰石（"HA"） 色谱分析法（参见，例如Aoyama，K.，Chiba，J.，Separation of Molecular Forms of Mouse IgG and IgM Monoclonal Antibodies in High Performance Liquid Chromatography on Spherical Hydroxyapatite Beads,J. Immunol. Methods, 162, 201-210 (1993)； Luellau,E. ,Marison, W. , von Stockar，IL，Ceramic Hydroxapatite: A New Tool for Separation and Analysis of IgA Monocolonal Antibodies, in Animal Cell Techn ology, Carondo, M. , ed. ,Kluwer Academic Publishers, Netherlands,265-269 (1997)； Luellau,E., von Stockar, U. , Vogt, S. , Freitag, R. , Development of a Downstream Process for the Isolation and Separation of Monoclonal Immunoglobulin A Monomer, Dimers, and Polymers from Cell Culture Supernatant, J. Chomatogr. A.，796，165-175 (1998) ;Yamakawa，Y.，Chiba，J.，High Performance Liquid Chromatography of Mouse Monoclonal Antibodies on Spherical Hydroxyapatite Beads, J. Liquid. Chromatogr. , 11, 665-681 (1998) ；Coppola, G. , Underwood, J. , Cartwrigh t, G. , Hearn, M. T. , High-performance Liquid Chromatography of Amino Acids，Peptides and Proteins:XCIII. Comparison of Methods for the Purification of Mouse Monoclonal Immunoglobulin M Autoantibodies,J. Chromatogr. A. , 476, 269-290(1989)； Josics, D. , Loster, K. , Kuhlj R. , Noll, F. , Reusch, J. , Purification of Monoclonal Antibodies by Hydroxylapatite HPLC and Size Exclusion HPLCj Biol.Chem. Hoppe-Seylars，372，149-156 (1991) ;Gagnon，P.，and Beam,K. , Antibody Aggregate Removal by Hydroxyapatite Chromatography，Curr. Pharm. Biotech. (2008))〇 [0008] 现有教导例如上述引用的这些还未证实对于从不正确折叠的依那西普中分离正 确折叠的依那西普的应用是有用的，因为它们不能提供定性和/或定量充足的样品。相应 地，在本领域中需要有效和高效的分离技术，以与能够提供非常高纯度（即，不正确折叠的 依那西普不存在或以非常低的水平存在）和在商业上有吸引力的产量的依那西普制备物 的、CHO细胞产生的依那西普联用。
[0009] 本发明采用号称的"混合模式"色谱分析法。当采用至少两种不同的力以结合蛋 白质时，用于纯化重组表达的蛋白质的色谱分析法可通常被称为"混合模式"，并可从不需 要的物质中分离所需的蛋白质产物，所述不需要的物质可存在于含所需蛋白质和不需要的 杂质的相对不纯的表达产物中。这些力可包括，例如，静电力和疏水力。
[0010] 混合模式色谱分析法以与更加传统的色谱分析技术相似的方式运作，因为具有固 定相和流动相。所述固定相通常为不溶性树脂或凝胶，通常被称为色谱树脂，其提供分离的 基础。所述树脂包含在允许液体通过并接触所述树脂的柱中。与树脂连接的选择的化学基 团或结构部分（moiety)的存在使所述色谱树脂从不需要的物质中分离所需物质的能力成 为可能。这些连接的基团，通常称为配体，赋予树脂必要的亲和性质（即，由配体中存在的 离子交换结构部分产生的静电吸引性质，和由配体中存在的疏水结构部分产生的疏水引力 性质），从而使所述树脂能够结合不纯样品中的一些蛋白质材料，而不是其它材料，当允许 含所述不纯样品的溶液流经所述色谱柱与所述树脂接触时。
[0011] 包含具有这些亲和基团的树脂的色谱柱的固定相塞满所述色谱柱的内部，所述色 谱柱通常是一个刚性圆柱体容器，流体可在一端被引入其中，接触所述树脂，然后在另一端 离开所述柱。通过将蛋白质产物放入适当的溶液中并允许所述溶液（称为流动相）经过所 述柱，可将含将被纯化的蛋白质的溶液引入（并因此允许其流过）所述柱。当将被纯化的 蛋白质产物（称为分析物）以流动相存在于柱中中时，在所述柱和所述流动相间达到平衡 状态，意味着蛋白质溶液中的一些物质将依附、结合或粘贴或被亲合基团捕捉到所述柱树 脂上，而所述产物中剩余的物质将不附在所述柱上，而是将流过并流出所述柱，在那儿其可 被收集用于分析、进一步加工，或其可被排放。
[0012] 一旦蛋白质分析物已以上述的方式结合到所述柱上，将使用洗涤步骤（通常称为 洗脱步骤）以从所述柱上洗脱或释放所结合的分析物。根据存在于树脂上以使分析物和所 述柱结合的亲和配体的类型（例如，基于电荷的结构部分或疏水部分，或它们的组合，等）， 用于从所述柱上洗脱或释放分析物的溶液必须对分析物和/或配体具有可克服分析物对 所述树脂的亲和力或吸引力的亲和力或吸引力（例如电荷性质、疏水性质、pH特性、盐浓度 等），从而使所述分析物从所述树脂（上述提到的固定相）上释放并进入洗脱介质（流动 相）。一旦被释放或洗脱至流动相，然后所述分析物可流过并流出所述色谱柱用于最后的收 集、分析等，或转移到进一步纯化的方法或过滤步骤。可理解的是，无论吸引性能或亲和性 能引起分析物结合至色谱树脂上（例如，电荷性能或疏水性能），后续用于洗脱或释放所述 分析物的流动相溶液都必须具有相互矛盾的一套性质以使所述分析物然后"优选"存在于 所述洗脱介质中而不是保持被捕获在所述柱树脂上。
[0013] 与其它单模式色谱分析技术相比，所谓的混合模式色谱分析法独特之处在于多种 结合和洗脱因素可相互依赖并可彼此相对。例如，当分析物的带电特性相对于所述柱树脂 的吸引力具有更强的对于洗脱介质的吸引力（倾向）时，在传统单一模式的离子交换色谱 分析法中，增加流动相的离子强度可引起树脂结合的分析物的洗脱或释放。然而，在混合 模式的色谱分析方法中，其中色谱树脂使用静电引力和疏水引力以结合分析物，增加流动 (洗脱）相的离子强度可引起样品物质从所述柱中释放，这是基于所述物质的电荷性质，同 时引起或增强分析物中疏水物质的结合，因为这样的疏水蛋白物质一在基于电荷的洗脱介 质存在下一相对于所述洗脱介质的带电环境，将倾向于具有更强的吸引力或优选以与所述 柱的疏水配体结合。相应地，虽然盐浓度的增加可确实引起从固定相置换带电蛋白物质的 倾向，当流动相中的带电离子与蛋白质竞争固定相上的结合位点时一然而，可能具有更高 程度的疏水性能的分析物产物混合物的那些部分可具有增强的保持与所述混合模式的色 谱柱的疏水结构部分结合的倾向。在任何给定的蛋白质分离情况下，利用这些现象的能力 几乎不能被认为是可预测的。
[0014] 混合模式树脂的两个实例为Capto? MMC和Capto? Adhere (可购自 GEHealthcare) oCapto? MMC利用附着于固体支撑基质的配体，其可通过阳离子交换（使用 它的羧基基团）、氢键结合和疏水作用与分析物相互作用。Capto? MMC的配体示例如下：
[0015]
[0016] Capto? Adhere与Capto? MMC相似之处在于它也米用附着于固体支撑基质的配 体。所述配体，N-苄基-N-甲基乙醇胺，也通过阴离子交换、氢键结合和疏水作用与分析物 相互作用。Capto? Adhere配体示例如下：
[0018] 在这两个配体中，疏水作用预期是弱的。因此，如果这些配体仅具有疏水结构部分 (没有电荷），那么它们将最可能需要盐析（蛋白质沉淀）条件用于蛋白质结合。然而，具 有静电作用可使如此弱的疏水作用足以提供额外的结合力。
【发明内容】
[0019] 本发明的前提是根据如下事实：可使用混合模式色谱分析法，例如使用Capto? MMC和Capto? Adhere作为混合模式色谱树脂，以纯化含正确折叠和不正确折叠蛋白质的 混合物的分析物，包括，例如，含正确折叠和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物，借此 正确折叠的蛋白质可以高效的方式和优异的产量从不正确或错误折叠的蛋白质中有效分 离，以得到高度富集所需的、正确折叠的蛋白质的蛋白质制备物。此外，本发明包含实践本 文描述的混合模式的色谱分离的能力，所述实践以使从所述色谱分离中得到可不含或基本 不含错误折叠产物（如果需要的话）的洗脱产物的方式进行，虽然可以理解，为了平衡产量 和纯度的目的，可能发现包括非常低水平的不正确折叠的产物（例如，少于5wt%并优选少 于3wt% )是可接受的以使产量最大化至所需的范围。
[0020] 相应地，在第一实施方案中，本发明是用于从不正确折叠的蛋白质中分离正确折 叠的蛋白质的混合模式色谱法，其包含以下步骤：(a)将同时含给定蛋白的正确折叠和不 正确折叠构象的第一蛋白混合物与同时具有离子交换结构部分和疏水结构部分的混合模 式色谱树脂结合；(b)从混合模式树脂上洗脱正确折叠的蛋白质以得到第二蛋白混合物， 所述第二蛋白混合物包含比所述第一蛋白混合物更高比例的正确折叠蛋白。术语"更高比 例"指在步骤（b)的洗脱液中正确与不正确折叠蛋白的比例至少高于1:1，但最优选高于 约8:2并优选高于约9:1。所述第二蛋白混合物最优选以构成第二蛋白混合物的至少约 95wt %的量包含正确折叠的蛋白。
[0021] 在第二实施方案中，所述方法涉及用于纯化蛋白质混合物以从存在于所述混合物 中的不正确折叠的依那西普中分离正确折叠的依那西普的混合模式色谱法，所述方法包括 以下步骤：(a)使具有疏水结构部分和离子交换结构部分的混合模式的色谱树脂与含包含 正确折叠的依那西普和不正确折叠的依那西普的蛋白质混合物的溶液接触，以使正确和不 正确折叠的依那西普粘附、结合或捕获在所述混合模式的色谱树脂上；和（b)使所述混合 模式的树脂与能够从所述混合模式的色谱树脂上洗脱依那西普蛋白质的溶液接触以得到 洗脱液，在该洗脱液中，正确折叠的依那西普的量与不正确折叠的依那西普的量的比率较 高，并优选比在步骤（a)中引入所述树脂的蛋白质混合物中的比率要高很多。
[0022] 第三实施方案中，本发明涉及一种含依那西普的蛋白质混合物，或含所述混合物 的药学上可接受的制剂，其是根据上述方法的实施方案得到且其中所述蛋白质混合物以构 成大于约90wt%的蛋白质混合物的量包含不正确折叠的依那西普；并以构成少于约5wt% 的蛋白质混合物的量包含不正确折叠的依那西普；且其中所述蛋白质混合物具有构成至少 约95wt. %并优选至少约98wt. %的含依那西普的蛋白质混合物的正确折叠和不正确折叠