一株能够产生细菌素的分散泛菌及其筛选方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术与医药领域，具体而言，涉及一株能够产生细菌素的分散泛 菌及其筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002] 细菌素（bacteriocin)是细菌产生的具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白复合 物，一般只对亲缘关系较近的细菌有毒害作用，产生菌对其产生的细菌素具有自身免疫性 (一般认为，产生菌的自我免疫力是因为含有免疫基因，其免疫机制可能是免疫基因产生的 免疫蛋白通过屏蔽受体蛋白，或竞争性干扰细菌素分子、阻塞孔道以阻止细菌素形成膜通 道）。
[0003] 细菌素的来源很广，可由革兰氏阳性菌（G+)、革兰氏阴性菌（G-)或某些古细菌产 生。其结构多样、无毒、无害、无残留的良好特性日渐成了人们关注和开发的焦点。利用细 菌素来预防和治疗动物疾病的研宄也日渐成为广大科学工作者们关注关心的焦点。
[0004] 大量体外试验结果表明，细菌素对食源性（如，李斯特氏菌、空肠弯曲菌、沙门氏 菌、大肠杆菌等）、植物源性、动物源性（如，条件致病菌一沙门氏菌、大肠杆菌等）、人源 性（抗药菌一金黄色葡萄球菌、肺炎球菌等）等各种临床致病菌都具有良好的抑杀作用。 1988年，Klaenhammer根据分子量大小、结构组成等不同将乳酸杆菌产生的细菌素分为4 类，这个分类标准也常用于其它细菌素的分类：
[0005]第1类为硫醚抗生素，该类细菌素分子量较小（小于10kDa)，一般含有羊毛硫氨 酸、0 -甲基羊毛硫氨酸及脱水氨基酸等异常氨基酸，这些异常氨基酸可以赋予这类细菌 素独特的环状刚性结构。根据环状结构的不同又可将硫醚抗生素分为两个亚类：A亚类是 具有螺旋状结构的两性分子，一般为21-38个氨基酸残基，分子量为2164?3488Da，带2-7 个正电荷。B亚类硫醚抗生素含有更多的球形分子，分子中一般不超过19个氨基酸残基，其 分子量小于A类（一般为1954?2041Da)，不带电荷，其抑菌作用是通过酶活性来实现的。
[0006] 第2类为不含羊毛硫氨酸的肽。这类细菌素分子量也较低（小于10kDa)，含30-60 个氨基酸残基，具有热稳定性。根据分子中特殊的N端序列、双组分通道结构及是否有功能 性巯基基团，这类细菌素又可分为3个亚类：IIa类是这类细菌素中最多的一类，它们的氨 基端都含有一段保守的序列（YGNGVXaaC)。与第1类的中A亚类一样，IIa类细菌素也是通 过使敏感菌细胞膜形成通道而达到杀菌作用，如pediocinAcH、sakacinA属于此类。IIb 类细菌素，如lacticinF、lactococcinG在革巴细胞质膜上形成由两种不同的蛋白质组成的 通道。IIc类细菌素是依赖于sec分泌途径的细菌素（如acidocinB)。
[0007] 第3类细菌素是分子量大于30KDa且不耐热的蛋白质。如helveticinsJ和 helveticinsV、lactacinB属于此类。第4类细菌素结构中包含其活性必需的脂类或碳 水化合物成分，如leuconocinS即为此类。
[0008] 在理化性能方面，大多数细菌素具有良好的热稳定性，这可能与它们独特的结构 有关。多数细菌素在100°c下几乎保持完全的活力，甚至在121°C下处理15min也仅仅损失 5%的活力。此外，细菌素不仅热稳定性好，其对pH值的耐受范围也相当宽。一般而言，细 菌素在pH值3-8下活力较高，有的甚至在pHl和pH12下还保持了很高的活力，然而，多数 细菌素在pH值较低下作用更强。
[0009] 与传统的广谱抗生素相比，细菌素的抑菌谱相对较窄。而G+菌细菌素的抑菌谱 比G-菌细菌素的抑菌谱更广，不仅可抑制各种G+菌，也可抑制G-菌。同时，G+菌细菌素 的抑菌谱范围差别很大，如lactococcinsA、B、M仅能抑制lactococcus，而nisin、mutacin Bny266的抑菌谱相当宽，对放线菌、梭菌、肠球菌、链球菌、葡萄球菌等均有抑制，甚至对一 些致病的G-菌（包括弯曲杆菌、嗜血杆菌等）也可杀灭。作为抗菌药物，虽然细菌素与抗 生素都是由微生物产生，但它们的产生机理及作用模式完全不同。细菌素是由细菌通过核 糖体途径合成的微生物初级产物，属于蛋白类物质，其作用机理主要是在细胞膜上形成通 道。而抗生素属于微生物次级代谢产物，不通过核糖体途径合成，而是由多酶复合体合成的 物质，其作用机理为抑制细胞壁的合成，抑制蛋白质、DNA的合成进而抑制细菌的生长。此 夕卜，与细菌素不同的是，核糖体蛋白抑制剂并不能阻碍抗生素的合成。
[0010] 在细菌素的作用机理方面，一般认为是其作用是阻止其它微生物菌株入侵产生菌 占据的小生境，防止入侵微生物建立菌群并限制它们成为附近的优势菌群，是微生物的一 个重要防御系统。最近还有学者提出了细菌素的另外作用机制：干预细菌的群体感应；如 nisinA作为一种蛋白质信息素可调控自身的表达，并且在姊妹细胞的程序性死亡中起"杀 手因子"的作用。再如，G-菌细菌素表现出两种典型的杀菌模式：在敏感菌细胞膜上形成离 子通道，或表现出核酸酶活性以进入敏感细胞。细菌素在发生作用前必须吸附在敏感菌细 胞膜特定的受体上，属于受体介导型吸附。与G-菌细菌素相比，G+细菌素对敏感菌的吸附 相对较弱，由于G+菌细胞壁可以允许更大的分子通过，因而不需要特定受体与之结合。无 论是硫醚细菌素还是非羊毛硫氨酸细菌素，它们都是在敏感菌质膜上形成疏水膜通道而影 响细胞膜的渗透压屏障，从而导致离子的渗漏、质子动势丢失，并最终导致细胞死亡。
[0011] 基于细菌素的良好抑菌作用，在19世纪20年代，科研人员从保加利亚农夫粪便中 分离出一种非致病的E.coli菌株Nissle1917 (Mutaflor)，该菌对许多致病菌具有抑制作 用，后来Mutaflor临床用于治疗便秘、痢疾及伤寒症。近年来，由于抗生素产生的耐药问题 越来越严重，人们开始寻找可对付耐药菌的抗生素替代药物，其中细菌素被认为是一个潜 力很大的抗菌剂。
[0012] 有研宄报道，表皮葡萄球菌细菌素p印5对于超级病菌"MRSA"有很强的抑制力， 对于控制医院内感染效果很好。Oscariz等从土壤中分离出一种赌样芽孢杆菌，它产生的细 菌素cerein7对万古霉素耐药的鸟链球菌及对替考拉丁耐药的马肠链球菌具有较强的抑 制活性，当某些G+致病菌对抗生素产生耐药时，cerein7可提供一种新的备用治疗。
[0013] 在我国，地衣芽孢杆菌制剂"整肠生"及枯草芽孢杆菌活菌制剂"白天鹅气雾剂"在 临床应用上也取得了很好的效果。因此，细菌素的不断研制与应用，不仅增加了人类可利用 药物的种类，更重要的是拓展了现有抗生素药物的使用寿命，由于细菌素"策划药"的出现， 各种抗生素不再频繁使用，这就减少了耐药菌的选择压力强度。从生态和进化角度上说，具 有抗菌谱窄的抗菌药的使用减少了多重耐药菌的威胁，耐药菌出现的频率及扩散速度也将 变得缓慢。
[0014] 结核分枝杆菌是结核病的致病菌。近年来，随着多重耐药结核病（MDR-TB)、广泛 耐药结核病（XDR-TB)及与HIV共感染结核病的出现，使结核病疫情在世界范围内有回升趋 势，成为危害人类健康的主要传染病之一。现阶段标准的结核病治疗方案是采用WHO推荐 的"4+2"疗法：前2个月用异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇来强化治疗，后4个月用异 烟肼和利福平持续治疗。然而，该标准疗法对MDR-TB、XDR-TB及HIV共感染TB没有治疗 效果。而且，过去20年几乎没有新型抗结核药物上市，因此，控制结核病急需新型抗结核药 物。
[0015] 鉴于细菌素是目前研宄较为彻底的微生物防御系统之一，而且由于它们种类多 样、来源丰富，已成为人类对付致病微生物的优选武器。因此，从寻找能够产生抗结核病致 病菌的细菌素的角度出发，获得能够产生抗结核病致病菌的细菌素及其产生菌有望为结核 病的控制和治疗开辟新的途径。
[0016] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0017] 本发明的目的在于提供能够产生细菌素的分散泛菌；该分散泛菌可以产生细菌 素，能够抑制结核病的致病菌（结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌），从而使其具有很好的临 床使用价值。
[0018] 本发明的另外一个目的在于提供一种上述分散泛菌的筛选方法，该方法以较廉价 的培养基培养产生分散泛菌（进一步产生活力较强的细菌素），且该方法较为简单易行、成 本较低。
[0019] 在本发明的实施例中提供了一种能够产生细菌素的分散泛菌，该菌为WH-1，属于 泛菌属，其在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNo:M2014508,保藏地址为： 中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编为430072。
[0020] 具体的，该菌的保藏时间为2014年10月23日；其分类名称为：分散泛菌WH-1， PantoeadispersaWH-1 ;该菌菌落呈现微小圆形，黄色突起较厚、边缘圆滑的特征。细胞 呈直杆状，0. 5-1. 0ymX1-3ym，以周生鞭毛运动，能产生黄色素，具有代谢和发酵类型的 化能异养菌。能利用D-葡萄糖和其它糖类产酸，但不产气。氧化酶阴性，接触酶阳性，吲哚 阴性。赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶以及精氨酸双水解酶皆阴性。产生H2S，不水解脲素，丙二酸 盐利用在菌株间可变，可还原硝酸盐；可发酵的糖类包括：L-阿拉伯糖、D-乳糖、麦芽糖、蔗 糖、海藻糖和木糖等。
[0021] 本发明提供的这种能够产生细菌素的分散泛菌，其通过培养而产生的细菌素具有 抑制结核病病原菌（结核分支杆菌和牛结核分支杆菌）的活性，可作为药物佐剂与一线抗 结核药物联合应用，对结核病以及MDR-TB、XDR-TB、HIV共感染TB进行控制治疗。另外，通 过实验证明，该菌产生的细菌素能够在两天内降低小鼠体内感染的结核分枝杆菌，从而使 其具有良好的临床使用价值。
[0022] 一种所述的分散泛菌的筛选方法，包括以下步骤：
[0023] 1)、采集土壤样品，在其中加入PBS缓冲液，震荡混匀后过滤，得到滤液溶液；
[0024] 2)、将所述滤液溶液稀释后与含有耻垢分枝杆菌的水琼脂培养基混合，作为上层 培养基；
[0025] 3)、将所述上层培养基倒入含有7H10固体培养基的培养皿中，于35-39°C培养至 产生抑菌圈，分离抑菌菌落，得到所述分散泛菌。
[0026] 可选的，在步骤1)中：所述土壤样品取自农村有机肥周边的湿润土壤中，且取样 深度为5-10cm。