一种细菌菌悬液的计数方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物检测方法，具体涉及一种药物中细菌菌悬液的计数方法。
【背景技术】
[0002] 细菌的菌悬液广泛应用于微生物限度检查中。并且《中国药典》微生物限度检查 法中明确规定了制成50?IOOcfu菌悬液方可用于实验，而现有常规法滴管吹散法进行操 作时，通过统计发现菌悬液计数准确率仅为66. 6%。并不能准确的用于计数，给药物的安全 性带来一定的隐患。
[0003] 因此，为了提高实际细菌计数的准确性，很有必要在现有技术的基础之上，设计研 发一种操作合理，可提高细菌计数准确性的细菌菌悬液的计数方法。
【发明内容】
[0004] 发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种操作合理，可提高细菌 计数准确性，提高药物临床安全性的新的细菌菌悬液的计数方法。
[0005] 技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案如下：
[0006] 一种细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007] (1)培养基的制备
[0008] 营养肉汤：取干粉培养基，按要求加入纯化水溶解，在110?125°c下灭菌15? 30min，调节 pH 至 7. 2±0· 2 ;
[0009] 营养琼脂：取干粉培养基，按要求加入纯化水溶解，在110?125°C下灭菌15? 30min，调节 pH 至 7. 2±0· 2 ;
[0010] ⑵菌悬液的制备
[0011] 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养 基中或营养琼脂培养基上，培养18?36小时；分别取上述培养物1?2ml加9?18ml (^^无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液⑴倍递增稀释至⑴八⑴气⑴人⑴入⑴人瓜^瓜^每步 稀释使用移液枪吸取，并且使用自动漩涡仪进行每一稀释级别的混合，制成每Iml含菌数 为50?IOOcfu(cfu为菌落形成单位，即指单位体积中的活菌个数）的菌悬液；
[0012] (3)细菌培养和计数
[0013] 取上述各稀释级别的菌悬液注入无菌平皿中，立即倾注15?20mL营养琼脂培养 基，每种菌悬液平行制备2?4个平皿，混匀，凝固，然后30?35°C培养48?72小时，计 数。
[0014] 作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤（1)中在121°C下灭菌 15min〇
[0015] 作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤（2)中，接种大肠埃希 菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基 上，培养18?24小时；分别取上述培养物lml，加9ml 0. 9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10 倍递增稀释至 10' 10' 10' 10' 10' 10' 10'
[0016] 作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤（2)中，自动漩涡仪的混 漩时间为30秒。本发明通过大量实验筛选，混漩时间，实验结果表明，在自动漩涡仪中混漩 30秒后，可以充分使各细菌均匀分布混匀。
[0017] 作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤（2)中移液枪的规格为 体积1000 μ 1。采用移液器，移液更加准确，并且采用自动漩涡仪进行混漩，可以很好的保证 细菌菌悬液的均匀一，从而可保证计数的准确性，又不会破坏细菌。
[0018] 作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤（3)中加入的营养琼脂 培养基的温度为45°C。本发明通过大量实验筛选，在稀释级别的菌悬液中添加入45°C营养 琼脂培养基，可以保证细菌的正常生存。
[0019] 作为优选方案，以上所述的细菌菌悬液的计数方法，步骤（3)中在30?35°C培养 48小时。
[0020] 本发明通过大量实验筛选，使用移液枪移取细菌稀释液，并且采用自动漩涡仪的 方法在你优选的时间内混匀，替传统的滴管吹散法，可大大提高细菌的均匀性，提高细菌计 数的准确性。
[0021 ] 本发明分别从混合的均一性、移液的准确性验证本发明提供的方法和现有技术进 行对比，实验结果如下表所示：
[0022] -、混合的均匀性
[0023] 本发明采用紫外分光光度法对同一浓度金黄色葡萄球菌0D600进行测定（0D600 即细菌培养液在600nm处的吸光值，得到的0D600的数值如果在0. 6?0. 8之间，表明细菌 处于旺盛生长的对数生长期）。
[0024] 通过对金黄色葡萄球菌0D600的测定，得到表1所示的数据。
[0025] 表1本发明改进后和现有药典方法改进前对细菌混合的均匀性的实验对比结果
[0026]
【主权项】
1. 一种细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 培养基的制备 营养肉汤：取干粉培养基，按要求加入纯化水溶解，在110?125°c下灭菌15?30min， 调节pH至L 2±0· 2 ; 营养琼脂：取干粉培养基，按要求加入纯化水溶解，在110?125°C下灭菌15?30min， 调节pH至L 2±0· 2 ; (2) 菌悬液的制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中 或营养琼脂培养基上，培养18?36小时；分别取上述培养物1?2ml加9?18ml0. 9%无 菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10' 1〇_2、1〇_3、1〇_4、1〇_5、1〇_ 6、1〇_7,每步稀释使 用移液枪吸取，并且使用自动漩涡仪进行每一稀释级别的混合，制成每Iml含菌数为50? IOOcfu的菌悬液； (3) 细菌培养和计数 取上述各稀释级别的菌悬液注入无菌平皿中，立即倾注15?20mL营养琼脂培养基，每 种菌悬液平行制备2?4个平皿，混匀，凝固，然后30?35°C培养48?72小时，计数。
2. 根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤（1)中在121°C下 灭菌15min〇
3. 根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤（2)中，接种大肠 埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培 养基上，培养18?24小时；分别取上述培养物lml，加9ml0. 9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲 液 10 倍递增稀释至 ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ-7。
4. 根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤（2)中，自动漩涡 仪的混漩时间为30秒。
5. 根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤（2)中移液枪的规 格为1000 μ 1体积。
6. 根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤（3)中加入的营养 琼脂培养基的温度为45 °C。
7. 根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤（3)中在30? 35°C培养48小时。
8. 根据权利要求1所述的细菌菌悬液的计数方法，其特征在于，步骤（3)中所述的计数 方法为移液器加入法。
【专利摘要】本发明公开了一种细菌菌悬液的计数方法，该方法包括培养基的制备，菌悬液的制备和细菌的培养和计数。本发明在现有技术的基础上，通过大量实验筛选，得到最佳的菌悬液的制备，细菌的培养方法，对比实验结果表明，本发明提供的细菌菌悬液的计数方法，可操作性强，移液准确，混合均匀，混合后细菌一致性好，可以大大提高计数的准确性。采用本发明的方法，平均计数准确率可达到95.0%，相比传统技术方法66.6%的准确率，计数更加准确，为保证药物临床疗效具有重要意义。
【IPC分类】C12Q1-10, C12Q1-06, C12Q1-14
【公开号】CN104561232
【申请号】CN201410715252
【发明人】樊文燕, 顾林, 李静
【申请人】扬子江药业集团南京海陵药业有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月1日