一种控制桡足类携带的总细菌数的方法
【专利摘要】本发明公开一种控制桡足类携带的总细菌数的方法。该方法的步骤为：制备浓度为2×102～2×105PFU/mL的蛭弧菌稀释液，再将蛭弧菌稀释液与谷氨酸钠和蔗糖的混合溶液按体积比1:1混合，得到蛭弧菌制剂；将蛭弧菌制剂与预处理过的含桡足类的水样进行混合。本发明提供的方法简单易行，适于工业化大批量生产，其中所含有的谷氨酸钠和蔗糖，对水体及桡足类本身无毒副作用，并不会引起水体的污染和桡足类等有益水生浮游生物的死亡。通过本发明的方法可有效控制桡足类携带的总菌，在24h内即可控制总菌数在103cfu/mL以内，并在较长时间内减缓其再生。
【专利说明】一种控制桡足类携带的总细菌数的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛭弧菌【技术领域】，特别涉及一种控制桡足类携带的总细菌数的方法。
【背景技术】
[0002]桡足类(Cop印oda)，隶属于节肢动物门、甲壳纲、桡足亚纲。为小型甲壳动物，体长< 3mm，营浮游与寄生生活，分布于海洋、淡水或半咸水中。桡足类活动迅速、世代周期相对较长，同样与其一样作为水产养殖中应用的饵料的还有桡足类和枝角类。桡足类作为水生有益浮游生物具有十分重要的意义。其不但是各种经济鱼类，如鳙、鲱、鲐和各种幼鱼、须鲸类的重要饵料，还可以作为渔场的标志，有些鱼类专门捕食桡足类，所以桡足类的分布和鱼群的洄游路线密切相关。有些桡足类的产量很大，如挪威沿海水域直接捕捞飞马哲水蚤可以作为人类、家畜和家禽的食料，具有很高的营养价值。同时其还可以作为水体污染的指示生物。但是，桡足类的体长较大，形态结构较为完整，是许多种类细菌的中间宿主。如果桡足类自身携带过多细菌，那么将对桡足类自身的生存及在水产养殖中的应用造成巨大影响及危害。总细菌数目过多，潜在的致病菌存在的可能性也就更大，其中可能存在的致病菌的种类和数目也会增加，会给对用其作为饵食的水产生物幼体造成病害。养殖户在水产生物育苗的过程中，会对引入的桡足类等饵料进行简单的过滤，或对其施用消毒剂以达到消毒的目的，这不但影响了桡足类的活性、可能还会引入新的细菌，更有可能在一定程度上杀死桡足类等浮游生物，同时破坏了养殖的水生生态环境，对水产生物的育苗产生不利影响。
[0003]因此，在使用桡足类作为优质饵料对水产生物育苗时，都应当对于其中携带的全部细菌引起重视。国内的许多研究都致力于将蛭弧菌制剂应用于控制病原菌，利用蛭弧菌天然的生物裂解活性，将蛭弧菌制剂施用于水体当中，可有效控制水体中的总细菌数目，从而降低其对于水产生物造成侵害的可能，从源头上控制水产生物病害的发生。目前将蛭弧菌制剂应用于控制水生浮游生物桡足类所携带的的总菌尚无报道。为了有效保障养殖水体及活生物饵料桡足类等的安全性，简单的消毒处理方式已无法满足需求。
[0004]应用蛭弧菌制剂控制桡足类所携带的的总菌，从源头上对水产养殖中存在的可能致病细菌进行防控，以形成具有疾病防预功能的养殖生态系统，具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种控制桡足类携带的总细菌数的方法。该方法创新性提出了一种蛭弧菌制剂在控制有益浮游生物桡足类所携带的总菌的方式；并可以适当的延长其制剂中的菌体活性。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种控制桡足类携带的总细菌数的方法，包括以下步骤:
[0007](I)制备蛭弧菌稀释液；
[0008](2)将步骤⑴制备的蛭弧菌稀释液与保护剂进行混合，即得到蛭弧菌制剂；
[0009](3)含桡足类(Cop印oda)的水样的预处理；
[0010](4)将步骤(2)蛭弧菌制剂与步骤(3)的含桡足类的水样进行混合。
[0011]所述的蛭弧菌优选为蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02，为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M209170 ;对所述的蛭弧菌进行进行负染后于电子显微镜下观察形态可知:BDS02呈单细胞，弧形，大小为0.65 X 0.2 μ m，端生鞭毛，鞭毛长度为1.8 μ m ;所述蛭弧菌BDS02用双层平板培养的方法于28°C培养四天可形成直径I?2mm的透明圆形卩遼菌斑；
[0012]所述的蛭弧菌稀释液优选通过以下步骤获得:
[0013]①宿主菌浓缩液的制备:挑取大肠杆菌单菌落(大肠杆菌E.coli，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号为GIM1.355),接种于营养肉汤液体培养基中，培养，得到培养液，然后将培养液离心，弃上清，每10mL培养液收集的沉淀用2?3mL DNB(dilutednutrient broth)液体培养基悬浮,得到宿主菌浓缩液,4°C保存备用；
[0014]②蛭弧菌稀释液的制备:按照蛭弧菌:宿主浓缩液:DNB液体培养基的体积比1: 1:50的比例进行混合，恒温培养，每24h添加一次宿主浓缩液，培养48h，得到培养液；将培养液离心，取上清液过滤，滤液使用质量体积比(g/mL) 1.5%盐度的灭菌蒸馏水调整其浓度，制备得到2X 12?2X 15PFU(plaque-formingunit)/mL的蛭弧菌稀释液；
[0015]所述的蛭弧菌优选为蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02,为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M209170 ；
[0016]步骤①中所述的营养肉汤液体培养基优选为营养肉汤18g/L，pH7.2，121°C高压灭菌15min后保存备用；
[0017]步骤①中所述的培养的条件优选为200rpm、28°C培养18h ；
[0018]步骤①中所述的离心的条件优选为4°C、6000rpm离心20min ；
[0019]步骤②中所述的恒温培养的条件优选为230rpm、28°C培养；
[0020]步骤②中所述的将培养液离心的条件优选为6000rpm、4°C离心20min ；
[0021]步骤②中所述的过滤优选为用0.45 μ m醋酸纤维素膜进行过滤；
[0022]步骤①和②中所述的DNB液体培养基，优选通过如下步骤制备:称取0.8g/L的营养肉汤，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.lg/L的酵母提取物，15g/L海水晶,用蒸懼水溶解混匀，调pH值至7.2?7.6，121°C 0.1MPa条件下处理20min保存备用；
[0023]步骤②中所述的质量体积比(g/mL) 1.5%盐度的灭菌蒸馏水优选用海水晶制备得到；
[0024]步骤(2)中所述的保护剂优选为质量体积比(g/mL) 5?25%谷氨酸钠和质量体积比(g/mL) 5?25%鹿糖的混合溶液；
[0025]步骤(2)中所述的蛭弧菌稀释液与保护剂进行混合优选按照蛭弧菌稀释液与保护剂进行体积比1:1混合；
[0026]步骤(3)中所述的含桡足类的水样的预处理方法，包括如下步骤:采集自桡足类的养殖水体的水样，将从养殖水体取得的水样静置30?35min，取上层带有浮游桡足类的水样，除去沉淀在底部的泥沙等杂质，即为实验所使用含桡足类的水样；经观察计数，其桡足类数目为3?4个/mL ;
[0027]步骤(4)中所述的混合优选将蛭弧菌制剂与含桡足类的水样按照体积比1: (10?100)混合；
[0028]本发明的机理是:通过向培养好的蛭弧菌中添加谷氨酸钠及蔗糖，制备成为一种蛭弧菌制剂，分别探讨不同浓度的蛭弧菌制剂对于桡足类所携带的总菌的控制效果。
[0029]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果:
[0030](I)本发明获得了一种蛭弧菌制剂的制备方法，通过该方法制备得到的蛭弧菌制剂可以在较长的时间内维持其制剂中蛭弧菌裂解活性。
[0031](2)本发明制备的蛭弧菌制剂中含有保护剂(谷氨酸钠和蔗糖的混合液)，而谷氨酸钠和蔗糖的混合液对水体及桡足类本身无毒副作用，同时不会引起水体的污染和桡足类等有益水生浮游生物的死亡。
[0032](3)本发明提供的蛭弧菌制剂的制备方法简单易行，适于工业化大批量生产，其中所含有的谷氨酸钠和蔗糖，选材广泛价格低廉，适用于推广使用。
[0033](4)本发明提供的该种蛭弧菌制剂可以有效的控制桡足类所携带的的总菌，在24h内即可控制总菌数目在103cfu/mL以内，并在较长的时间内减缓其再生。
[0034](5)本发明中所述的蛭弧菌制剂的浓度可以根据实际应用的需要进行适当的调整，以达到最佳的控制桡足类所携带的总菌目的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1是实验组A、实验组B、实验组C和实验组Cl的实验效果比对图。
[0036]图2是实验组A、实验组B、实验组D和实验组Dl的实验效果比对图。
[0037]图3是实验组A、实验组B、实验组E和实验组El的实验效果比对图。
[0038]图4是实验组A、实验组B、实验组F和实验组Fl的实验效果比对图。
[0039]图5是实验组A、实验组B、实验组C、实验组D、实验组E和实验组F的实验效果比对图。
【具体实施方式】
[0040]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0041]下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件。
[0042]蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02为2009年8月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC N0:M209170。对所述的蛭弧菌进行进行负染后于电子显微镜下观察形态可知:BDS02呈单细胞，弧形，大小为0.65X0.2 μ m，端生鞭毛，鞭毛长度为1.8 μ m ;所述蛭弧菌BDS02用双层平板培养的方法于28°C培养四天可形成直径I?2mm的透明圆形卩遼菌斑。蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02在中国专利申请文件“申请号:200910042275.0，名称为:一种消除水产品革兰氏阳性致病菌的蛭弧菌菌株及其应用”中公开。
[0043]实施例1
[0044]具体实验方法如下:
[0045]一、材料、培养基和溶液
[0046](I)材料
[0047]蛭弧菌:BDS02。
[0048]宿主菌:大肠杆菌GMl.355，购于广东省微生物所菌种保藏中心。
[0049]含桡足类(Copepoda)的水样:采集自海南省文昌市铺前镇的海水养殖场的含有针刺尖头水蚤(Arietellus aculeatus)的养殖水体的水样,经观察计数,其烧足类数目大约在3个/mL。
[0050](2)培养基
[0051]2216E佐贝尔海洋细菌培养基:海水晶15g，蛋白胨5g，酵母浸膏lg，磷酸高铁0.0lg，蒸馏水100mL, ρΗ7.6?7.8，琼脂15g。121。。0.1MPa下灭菌20min后倾注平板保存备用。
[0052]TCBS琼脂培养基(弧菌选择性培养基):TCBS琼脂89g，加入蒸馏水lOOOmL，搅拌加热煮沸至完全溶解，倾注灭菌平板保存备用。
[0053]营养肉汤液体培养基:营养肉汤18g/L，pH7.2，121°C高压灭菌15min后保存备用。
[0054]DNB液体培养基:营养肉汤0.8g/L，酪蛋白酸水解物0.5g/L，酵母提取物0.lg/L,15g/L海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调pH值至7.2?7.6，121 °C 0.1MPa条件下处理20min保存备用。
[0055](3)溶液
[0056]PBS (磷酸缓冲液)缓冲液(0.1M):量取0.2mol/L磷酸二氢钠(27.8g磷酸二氢钠定容至lOOOmL) 28mL和0.2mol/L磷酸氢二钠(53.65g七水磷酸氢二钠定容至lOOOmL) 72mL混合均匀，用蒸馏水定容至200mL，即为0.1moI/LPBS溶液，pH约为7.2。
[0057]二、实验方法
[0058](I)宿主菌浓缩液的制备
[0059]挑取大肠杆菌单菌落(大肠杆菌E.coli，购于广东省微生物所菌种保藏中心，编号为GMl.355)，接种于营养肉汤液体培养基中，200rpm、28 °C培养18h，得到培养液，然后将培养液4°C、6000rpm离心20min，弃上清，每10mL培养液收集的沉淀用2?3mLDNB(diluted nutrient broth)液体培养基悬浮,得到宿主菌浓缩液,4?保存备用；
[0060](2)蛭弧菌稀释液的制备
[0061]按照蛭弧菌:宿主浓缩液:DNB液体培养基的体积比1:1:50的比例进行混合，230rpm、28 V恒温培养，每24h添加一次宿主浓缩液，培养48h,得到培养液；将培养液6000rpm、4°C离心20min,取上清液用0.45 μ m醋酸纤维素膜进行过滤，滤液使用质量体积比(g/mL) 1.5%盐度的灭菌蒸馏水调整其浓度，分别得到I X 12PFU(plaque-formingunit) /mL、I X 103PFU/mL、I X 104PFU/mL、I X 105PFU/mL 和 2 X 12PFU (plaque-formingunit)/mL、2X 103PFU/mL、2X 104PFU/mL、2X 105PFU/mL 的 8 种浓度的蛭弧菌稀释液。
[0062](3)蛭弧菌制剂样品的制备
[0063]将步骤(2)中培养稀释后的2X 102PFU/mL、2X 103PFU/mL、2X 104PFU/mL 和2X105PFU/mL4种浓度的蛭弧菌稀释液，按照体积比1:1的比例添加含有质量体积比(g/mL)6% (w/v)鹿糖和质量体积比(g/mL)6% (w/v)谷氨酸钠的混合溶液,从而得到制备出的均含有质量体积比(g/mL)3% (w/v)鹿糖和质量体积比(g/mL)3% (w/v)谷氨酸钠的4种浓度的蛭弧菌制剂。
[0064]使用DNB双层平板法检测其蛭弧菌制剂中蛭弧菌的活菌浓度并记录，即作为蛭弧菌制剂，并可将其应用于控制桡足类所携带的的总菌当中。
[0065](4)实验用样品的处理及实验组设置
[0066]实验用水样的处理:由于桡足类大小多为体长< 3mm，因此在处理实验用水样时，将从养殖水体取得的水样若干静置30min，倾倒出上层带有浮游桡足类的水样，除去沉淀在底部的泥沙等杂质，即为实验所使用的水体样本。吸取1mL水样进行观察，记录其中的桡足类数目，即为实验用所含桡足类的水样。
[0067]实验组设置:对于所取养殖水体，通过设置对照组、不同浓度的蛭弧菌制剂进行实验，每个实验组别的具体设置如下，即实验组A?Fl:
[0068]实验组A:每50mL实验水样中添加ImL灭菌的质量体积比(g/mL) 15%。盐度蒸馏水，作为对照组。
[0069]实验组B:每50mL实验水样中添加ImL含有质量体积比(g/mL) 3% (w/v)谷氨酸钠和质量体积比(g/mL) 3% (w/v)鹿糖的混合溶液。
[0070]实验组C:每50mL实验水样中添加ImL步骤(3)中制备的浓度为102PFU/mL的蛭弧菌制剂。
[0071]实验组Cl:每50mL实验水样中添加ImL步骤⑵中制备的浓度为102PFU/mL的蛭弧菌稀释液，作为受试的不含保护剂的蛭弧菌制剂。
[0072]实验组D:每50mL实验水样中添加ImL步骤(3)中制备的浓度为103PFU/mL的蛭弧菌制剂。
[0073]实验组Dl:每50mL实验水样中添加ImL步骤⑵中制备的浓度为103PFU/mL的蛭弧菌稀释液，作为受试的不含保护剂的蛭弧菌制剂。
[0074]实验组E:每50mL实验水样中添加ImL步骤(3)中制备的浓度为104PFU/mL的蛭弧菌制剂。
[0075]实验组El:每50mL实验水样中添加ImL步骤⑵中制备的浓度为104PFU/mL的蛭弧菌稀释液，作为受试的不含保护剂的蛭弧菌制剂。
[0076]实验组F:每50mL实验水样中添加ImL步骤⑶中制备的浓度为105PFU/mL的蛭弧菌制剂。
[0077]实验组Fl:每50mL实验水样中添加ImL步骤⑵中制备的浓度为105PFU/mL的蛭弧菌稀释液，作为受试的不含保护剂的蛭弧菌制剂。
[0078]实验组A?Fl的10个实验组别，每个做3个平行，每个平行样品水样为50mL使用三角烧瓶盛装，置于无菌恒温箱内，室温25°C放置Id后开始进行实验，容器上方覆盖灭菌塑料膜密封，防止灰尘等杂物污染，以使水体中的细菌菌群达到稳定。对于实验组A?F1，每24h添加一次对应的实验样品，按照后续的检测要求进行检测。
[0079](5)取样检测
[0080]对于所有实验组别，在添加蛭弧菌制剂等后立即取样检测，即为Oh的检测值，后续每隔24h取样进行检测，取样时间点分别为0h、24h、48h、72h和96h，取样的全过程都严格遵循无菌操作，具体操作方法如下:
[0081]对于桡足类的取样处理方式:使用接种针挑取I个桡足类浮游生物个体放入灭菌培养皿，再通过研钵碾碎后，用ImL的质量体积比(g/mL) 15%。咸淡水冲洗，整个取样过程都严格遵循无菌操作，在超净台内进行，所得的液体即为待检测桡足类样品。
[0082](6)总细菌数的检测
[0083]在到达设定的检测时间点时，将步骤(5)中的取样处理后的桡足类样品使用PBS缓冲液按10倍梯度进行稀释，取各梯度稀释液0.lmL，均匀涂布于2216E佐贝尔海洋细菌培养基平板，将平板倒置于28°C恒温培养箱中培养4?5d，计算出样品中的总细菌浓度，单位为 cfu/mL0
[0084](7)数据分析
[0085]实验中各实验组3个平行样品菌数检测的数值取平均值，使用MS Excel进行显著性分析，可信度高，菌数检测结果均以平均数土标准差的形式表示。
[0086]三、实验结论
[0087]蛭弧菌制剂对桡足类所携带的总菌的控制
[0088](I)浓度为102PFU/mL的蛭弧菌制剂的实验效果比对
[0089]图1可以清晰看出，实验期间，对照组中的总细菌数量随着时间的推移变化不显著，在O?96h内其总细菌数目维持在108cfu/mL左右，总体呈现平稳趋势，达到
9.23X 107cfu/mLo添加质量体积比(g/mL) 3%谷氨酸钠+质量体积比(g/mL) 3%鹿糖组,其中的总细菌数的变化趋势与对照组相同，在O?96h内其总细菌数目对数值变化在±0.52个数量级，并且在96h时其终总菌数达到稳定，为9.83X 107cfu/mL。上述两个实验组，相同时间点差异不大，O?96h内总细菌数变化无显著差异，并且组内不同时间点时的总细菌数，在O?96h内无明显差异。添加浓度为102PFU/mL的不含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组Cl)，在首次添加蛭弧菌制剂后，O?24h内就对于总菌有一定程度的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的9.23X 107cfu/mL降至3.69 X 106cfu/mL，并且随着每24h添加入蛭弧菌制剂，可以在一定程度上减缓细菌的增长；添加浓度为102PFU/mL的含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组C)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制剂后，O?24h内就对于总菌有较好的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的9.23X 107cfu/mL降至5.36 X 14Cfu/mL，并且随着每24h添加入蛭弧菌制剂，可以有效的减缓细菌的增长，其相同时间点总细菌数目的变化与对照组、3%谷氨酸钠+3%蔗糖组以及不含有保护剂的蛭弧菌制剂组均存在显著差异。
[0090](2)浓度为103PFU/mL的蛭弧菌制剂的实验效果比对
[0091]图2可以清晰看出，实验期间，对照组与添加质量体积比(g/mL) 3%谷氨酸钠+质量体积比(g/mL) 3%蔗糖组，其中的总细菌数的变化趋势与浓度为102PFU/mL的蛭弧菌制剂的实验效果相同。添加浓度为103PFU/mL的不含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组Dl)，在首次添加蛭弧菌制剂后，O?24h内就对于总菌有一定程度的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的9.23X 107cfu/mL降至1.24X 106cfu/mL,并且随着每24h添加入蛭弧菌制剂，可以在一定程度上减缓细菌的增长；添加浓度为103PFU/mL的含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组D)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制剂后，O?24h内就对于总菌有较好的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的9.26X 107cfu/mL降至4.87 X 104cfu/mL,并且随着每24h添加入蛭弧菌制剂，可以有效的减缓细菌的增长，其相同时间点总细菌数目的变化与对照组、3%谷氨酸钠+3%蔗糖组以及不含有保护剂的蛭弧菌制剂组均存在显著差异。
[0092](3)浓度为104PFU/mL的蛭弧菌制剂的实验效果比对
[0093]图3可以清晰看出，实验期间，对照组与添加质量体积比(g/mL) 3%谷氨酸钠+质量体积比(g/mL) 3 %蔗糖组，其中的总细菌数的变化趋势与浓度为102PFU/mL的蛭弧菌制剂的实验效果中相同。添加浓度为104PFU/mL的不含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组El)，在首次添加蛭弧菌制剂后，O?24h内就对于总菌有一定程度的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的9.23X 107cfu/mL降至5.89X 105cfu/mL,并且随着每24h添加入蛭弧菌制剂，可以在一定程度上减缓细菌的增长；添加浓度为104PFU/mL的含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组E)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制剂后，O?24h内就对于总菌有较好的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的9.39X 107cfu/mL降至2.59 X 102cfu/mL，并且随着每24h添加入蛭弧菌制剂，可以有效的减缓细菌的增长，其相同时间点总细菌数目的变化与对照组、3%谷氨酸钠+3%蔗糖组以及不含有保护剂的蛭弧菌制剂组均存在显著差异。
[0094](4)浓度为105PFU/mL的蛭弧菌制剂的实验效果比对
[0095]图4可以清晰看出，实验期间，对照组与添加质量体积比(g/mL) 3 %谷氨酸钠+质量体积比(g/mL) 3 %蔗糖组，其中的总细菌数的变化趋势与浓度为102PFU/mL的蛭弧菌制剂的实验效果中相同。添加浓度为105PFU/mL的不含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组Fl)，在首次添加蛭弧菌制剂后，O?24h内就对于总菌有一定程度的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的9.23X 107cfu/mL降至3.21 X 106cfu/mL,并且随着每24h添加入蛭弧菌制剂，可以在一定程度上减缓细菌的增长；添加浓度为104PFU/mL的含有保护剂的蛭弧菌制剂组别(即实验组F)，可以看出，在首次添加蛭弧菌制剂后，O?24h内就对于总菌有较好的控制，使总细菌数目快速下降，由初始的9.41 X 107cfu/mL降至4.33 X 104cfu/mL,并且随着每24h添加入蛭弧菌制剂，可以有效的减缓细菌的增长，其相同时间点总细菌数目的变化与对照组、3%谷氨酸钠+3%蔗糖组以及不含有保护剂的蛭弧菌制剂组均存在显著差异。
[0096]综上所述，对比发现，所有不含有3%谷氨酸钠+3%蔗糖的单纯蛭弧菌制剂在控制桡足类携带细菌中的效果均没有含有3%谷氨酸钠+3%蔗糖的混合蛭弧菌制剂的效果好，其2者存在显著差异，因此说明，添加了保护剂的蛭弧菌制剂在控制桡足类中总细菌数目的效果上，好于未添加的组别，因此后面的研究集中于对比不同浓度的含有保护剂蛭弧菌制剂对于桡足类携带细菌的控制效果。
[0097](5)不同浓度蛭弧菌制剂效果比对
[0098]图5可以清晰看出，实验期间，对照组中的总细菌数量随着时间的推移变化不显著，在O?96h内其总细菌数目维持在108cfu/mL左右；添加质量体积比(g/mL) 3%谷氨酸钠+质量体积比(g/mL)3%蔗糖组，其中的总细菌数的变化趋势与对照组相同，在O?96h内其总细菌数目对数值变化在±0.52个数量级，并且在96h时其终总菌数达到稳定。上述两个实验组，相同时间点差异不大，O?96h内总细菌数变化无显著差异，并且组内不同时间点时的总细菌数，在O?96h内无明显差异。添加不同浓度蛭弧菌制剂的组别均对于桡足类所携带的的总菌有较好的控制效果，观察对比102PFU/mL、103PFU/mL、104PFU/mL和105PFU/mL4种浓度的蛭弧菌制剂的控制效果发现，104PFU/mL浓度的蛭弧菌制剂可以对桡足类所携带的的总菌有较好的控制效果，其在24h就可以使其中的总细菌数目下降5个数量级，而其他浓度的蛭弧菌制剂在24h时，对于桡足类所携带的的总菌的控制效果没有104PFU/mL浓度的蛭弧菌制剂好，在对于总菌对数值的控制上较104PFU/mL浓度的蛭弧菌制剂少2个数量级，但仍然具备一定的控制效果。
[0099]同时，对比对照组和质量体积比(g/mL) 3%谷氨酸钠+质量体积比(g/mL)3%蔗糖组发现，向含有桡足类的水体中投放浓度为质量体积比(g/mL) 3%谷氨酸钠+质量体积比(g/mL)3%蔗糖的混合溶液并未使其中的总细菌数目有显著变化，并且不含有保护剂的蛭弧菌制剂具有一定的控制效果，但是没有与保护剂共同使用时的协同效果好，这表明在制备蛭弧菌制剂中添加的谷氨酸钠和蔗糖对于含有桡足类的水体及桡足类本身无污染及毒副作用，还可以获得更加优异的控制效果。因此，其可以用于蛭弧菌制剂的制备当中。
[0100]总之，104PFU/mL的蛭弧菌制剂即可在24h快速的降低桡足类所携带的的总菌数目，并且随着每24h添加一次蛭弧菌制剂，对于桡足类所携带的总菌的控制效果可以在较长时间内得到维持，是一种良好的防控水体及桡足类所携带的总菌的有益菌制剂，将其投入大规模生产后，相信其可以对当前的水产养殖业及食品加工行业都产生重大深远的影响。
[0101]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种控制桡足类携带的总细菌数的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)制备蛭弧菌稀释液； (2)将步骤(I)制备的蛭弧菌稀释液与保护剂进行混合，即得到蛭弧菌制剂； (3)含桡足类的水样的预处理； (4)将步骤(2)蛭弧菌制剂与步骤(3)的含桡足类的水样进行混合。
2.根据权利要求1所述的控制桡足类携带的总细菌数的方法，其特征在于: 所述的蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibr1 sp.)BDS02，为2009年8月7日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 209170。
3.根据权利要求1所述的控制桡足类携带的总细菌数的方法，其特征在于: 所述的蛭弧菌稀释液的浓度为2 X 12?2X 105PFU/mL。
4.根据权利要求1所述的控制桡足类携带的总细菌数的方法，其特征在于: 所述的保护剂为质量体积比5?25%谷氨酸钠和质量体积比5?25%蔗糖的混合溶液。
5.根据权利要求1所述的控制桡足类携带的总细菌数的方法，其特征在于: 步骤(2)中所述的蛭弧菌稀释液与保护剂进行混合按照蛭弧菌稀释液与保护剂进行体积比1:1混合。
6.根据权利要求1所述的控制桡足类携带的总细菌数的方法，其特征在于: 所述的含桡足类的水样中的桡足类数目在3?4个/mL。
7.根据权利要求1所述的控制桡足类携带的总细菌数的方法，其特征在于: 步骤(4)中所述的混合是将蛭弧菌制剂与含桡足类的水样按照体积比1: (10?100)混合。
8.根据权利要求1所述的控制桡足类携带的总细菌数的方法，其特征在于: 所述的蛭弧菌稀释液通过以下步骤获得: ①宿主菌浓缩液的制备:挑取大肠杆菌单菌落，接种于营养肉汤液体培养基中，培养，得到培养液，然后将培养液离心，弃上清，每10mL培养液收集的沉淀用2?3mL DNB液体培养基悬浮，得到宿主菌浓缩液，4°C保存备用； ②蛭弧菌稀释液的制备:按照蛭弧菌:宿主浓缩液:DNB液体培养基的体积比1:1:50的比例进行混合，恒温培养，每24h添加一次宿主浓缩液,培养48h,得到培养液；将培养液离心，取上清液过滤，滤液使用质量体积比1.5%盐度的灭菌蒸馏水调整其浓度，制备得到2X 12?2 X 105PFU/mL的蛭弧菌稀释液。
9.根据权利要求8所述的控制桡足类携带的总细菌数的方法，其特征在于: 步骤①中所述的营养肉汤液体培养基为营养肉汤18g/L，pH7.2，121°C高压灭菌15min后保存备用； 步骤①中所述的培养的条件为200rpm、28°C培养18h ； 步骤①中所述的离心的条件为4°C、6000rpm离心20min ； 步骤②中所述的恒温培养的条件为230rpm、28°C培养； 步骤②中所述的将培养液离心的条件为6000rpm、4°C离心20min ； 步骤②中所述的过滤为用0.45 μ m醋酸纤维素膜进行过滤； 步骤②中所述的质量体积比1.5%盐度的灭菌蒸馏水用海水晶制备得到。
10.根据权利要求8所述的控制桡足类携带的总细菌数的方法，其特征在于: 步骤①和②中所述的DNB液体培养基，通过如下步骤制备:称取0.8g/L的营养肉汤，.0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.lg/L的酵母提取物，15g/L海水晶，用蒸馏水溶解混匀，调pH值至7.2?7.6，121°C 0.1MPa条件下处理20min保存备用。
【文档编号】A61K35/74GK104126529SQ201410269824
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】蔡俊鹏, 孙秋平, 郭衍彪 申请人:华南理工大学