靶rna的检测、定量方法和试剂盒的制作方法

专利名称：靶rna的检测、定量方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及靶RNA的检测、定量方法和试剂盒，更具体而言，涉及组合了 DNA微阵 列技术和核酸扩增技术的RNA的检测、定量方法以及RNA的检测、定量试剂盒。
背景技术：
关于细菌的鉴定，除了以往一直在使用的通过培养的鉴定方法、通过染色进行的 鉴定方法、或测量ATP等涉及细菌的代谢的物质的方法之外，正在开发出例如使用DNA微阵 列技术的细菌鉴定方法。特别是合成相对于某细菌的基因序列具有特异性碱基序列的核酸 作为探针，并将其固定在基板上使其与由检样扩增的基因杂交的方法，由于使用各菌种所 具有的特异性碱基序列，因此可以进行准确检测，目前各种形式的应用正在发展(参照专 利文献1 3和非专利文献1)。例如，作为定量解析方法中的一种，例如有采用实时PCR法的检测方法。利用这种 实时PCR法时，可以用微量的检样量进行定量检测，但检验需要时间，另外，为了重现性良 好地进行定量，需要预先调查每个模板或引物适合定量的循环数，操作繁琐。此外，作为可以检测出特定菌种或品种的方法，提出了作为RNA特异性核酸扩增 方法的基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid SequenceBased Amplification, NASBA)法。 NASBA法是用2种引物在对象RNA上对互补的反义RNA进行扩增的方法，由于可以在41°C 的恒定温度下，以RNA作为模板在短时间内进行核酸扩增，因此可以在常温下进行反应，而 不需要温度调节设备等。另外，由于也不需要考虑引物的Tm值等，因此可以简便地检测多 种核酸。此外，由于与RT-PCR不同，可以在DNA存在下进行RNA的扩增和检测，因此可以通 过评价细菌的存活来排除由死亡细菌造成的假阳性的可能性。但是，NASBA法虽然可以同 时简便地定性检测多种核酸，但一直难以简便地定量检测多种核酸。另一方面，肺炎在日本人的以死因区分的死亡率(cause-specificdeath rate)中 位于第4位，作为癌症等基础疾病的并发症经常发生，作为患者数量非常多的疾病而被人 们所知。以往作为成为肺炎原因的微生物(病原菌)的探索试验而进行的培养检验至少需 要数天时间，如果再对培养后的病原菌进行药物敏感性试验则要花费近1周的时间，因此 不是十分有助于治疗选择的检验方法。有报告指出对于需要在重症监护病房(ICU)住院的 重症肺炎，迅速且准确地确定病原菌在治疗选择中极为重要，恰当的初期治疗可以切实地 提高肺炎患者的获救概率。但实际上，现状是由于仍然未确立代替培养法的病原菌鉴定技 术，因而必须在病原菌不明的状态下进行治疗。因此，不得不根据经验治疗使用抗生素，结 果可能导致耐药菌的出现。成为肺炎原因的病原菌中，发生频率高的菌种占全部的近50%，包括病毒在内的 主要病原菌为20 30种左右。其中有无法用常用方法培养的病原菌，通过培养法难以确 定病原菌的情况也很多。另外，利用使用以往的DNA微阵列技术的微生物检测方法时，对于 即使是微小的感染量也会引起肺炎的肺炎病原菌的检测、或者同时检测多种菌来说是有效 的，但在重现性良好地进行定量解析方面存在问题。特别是在需要依靠菌量来适当选择抗生素进行治疗的肺炎中，同时检测多种肺炎病原菌、以及检测信号的定量解析 是非常重要 的。此外，最佳治疗药物根据病原菌的种类不同而不同，但在确定病原菌前就开始治疗的情 况在医疗伦理上也是不得已的实情。为了解决这些问题，有待开发可以从多种菌种中迅速 且定量地检测特定菌的方法。专利文献1 日本特开2002-512688号公报专利文献2 日本特开2006-025791号公报专利文献3 日本特开2006-061155号公报非专利文献1 :Schena M.等，(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (20) 10614-9

发明内容
本发明的课题在于，提供在对一种或多种病原微生物进行检测、定量等情况下，可 以从试样中微量的RNA中简便且迅速地检测、定量靶RNA的方法和试剂盒。本发明人为了检测多种菌类微量的基因，已经着眼于使用蛋白质合成器官即核糖 体的构成成分之一的16SrRNA序列作为引物。16SrRNA的碱基序列可以在所有细菌中得到， 另外，作为16SrRNA的特征，具有共有的碱基序列部分和菌特异性碱基序列部分，因此开发 了利用该特性设计用于检测菌特异性序列的引物，使用多重PCR法同时使多个基因扩增， 再通过使用微阵列的PCR法对该扩增产物进行定量检测的方法，从而提出了检测10个菌种 的肺炎病原菌基因的方法(山口大学和住友《一々7 4卜共同开发，发明专利申请中日 本特愿2007-207966)。但是，该方法需要DNA扩增设备或微阵列扫描仪，因此中小型医院或 诊所大多难以进行检验。根据这样的现状，为了开发不使用特殊设备就可以简便地进行检 测的诊断设备，首先开发出了世界上首个可以同时对NASBA法的工序中制成的双链DNA进 行扩增和定量检测的核酸扩增定量法，这种方法在使用荧光测定装置的测定系统中使用液 相引物和固相引物的3种引物，在恒定温度下进行RNA扩增。但是，在该检测系统中，只能 确认可以检测一个菌种。另外，在以往的NASBA法中所用的逆转录引物是用于将临床样本 中的RNA转换为DNA的引物，由于加入溶液中故浓度设定很重要。新的基因检测法中的浓 度设定取决于混合了几种逆转录引物，但检测目的基因的种类如果增加则逆转录引物的种 类也必须增加，由于耐药性基因没有共有区域，因此必须追加与耐药性基因数量相符的逆 转录引物。此次，本发明人得到了采用多重PCR法中所用的引物组(Primer set)，可以一次 检测具有多种靶碱基序列的核酸的构思，尝试使用NASBA法中的试剂和多个引物进行RNA 的检测、定量，但是NASBA试剂下的多菌种扩增交叉反应多而无法得到优选的结果。因此， 发现通过在孔型微阵列基板上，用多种引物使NASBA法的工序中制成的双链DNA扩增，可以 短时间且简便地检测、定量试样检样中的多种DNA序列，从而完成了本发明。即本发明涉及[1]靶RNA的检测、定量方法，其特征在于，包括以下的(a) (j) 的工序。(a)将含有与靶RNA的5’端靶特异性序列相对应的DNA序列的引物的5’末端固 定在基板表面，制备固相DNA(+)引物的工序；(b)在含有与靶RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚 合酶启动子序列，制备液相cDNA(-)引物的工序；(b’ )根据需要，制备在标签序列的5’末端附加RNA聚合酶启动子序列的液相通用引物的工序；(c)制备含有靶RNA的3’端序列和5’端靶特异性序列的试样RNA的工序；(d)使工序(b)中制备的液相cDNA㈠引物与工序(c)中制备的试样RNA链在液 相中接触，使液相cDNA(-)引物与试样RNA杂交，然后通过逆转录酶使DNA(-)链延长，制备 cDNA链-RNA链复合体的工序；(e)使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工序(d) 中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备单链DNA㈠的工序；(f)使工序(e)中制备的单链DNA㈠与工序(a)中制备的固相DNA⑴引物在液 相中接触，使单链DNA(-)与固相DNA⑴引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚合酶活 性的酶使DNA(+)链延长制备双链DNA的工序；(g)使RNA聚合酶作用于工序(f)中制备的双链DNA，利用来自DNA㈠链的RNA 聚合酶启动子序列使单链RNA(-)扩增，使扩增的单链RNA(-)与固相DNA⑴引物杂交，然 后通过逆转录酶使DNA(+)链延长制备cDNA链-RNA链复合体的工序；(h)使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工序(g) 中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备固相单链DNA⑴的工序；⑴使工序(h)中制备的固相单链DNA(+)与工序(b)中制备的液相cDNA(-)弓丨物 或工序(b’ )中制备的液相通用引物在液相中接触，使单链DNA⑴与液相cDNA㈠弓丨物或 液相通用引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶使DNA(-)链延长，制备 双链DNA的工序；(j)对工序(f)和工序⑴中制备的双链DNA进行定量的工序；另外，本发明涉及[2]上述[1]记载的检测、定量方法，其特征在于重复两次以上 工序(g) 工序(i) ； [3]上述[1]或[2]记载的检测、定量方法，其特征在于在同一反应液 中进行工序(d) 工序(j) ； [4]上述[1] [3]中任一项记载的检测、定量方法，其特征在 于在同一基板上对多个靶RNA进行检测、定量；[5]上述[1] [4]中任一项记载的检测、 定量方法，其特征在于在工序(i)中使用液相通用引物；[6]上述[5]记载的检测、定量方 法，其特征在于液相通用引物的浓度为液相cDNA(-)引物浓度的10倍以上；[7]上述[1] [6]中任一项记载的检测、定量方法，其特征在于液相cDNA(-)引物是通过标签序列，在含 有与靶RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列 制成的液相嵌合引物；[8]上述[1] [7]中任一项记载的检测、定量方法，其特征在于使 用RNA聚合酶启动子序列是标记的启动子序列的、液相通用引物或液相嵌合引物；[9]上 述[8]记载的检测、定量方法，其特征在于标记的启动子序列是生物素标记的启动子序列； [10]上述[1] [7]中任一项记载的检测、定量方法，其特征在于在标记试剂的存在下进行 工序(i) ； [11]上述[10]记载的RNA的检测、定量方法，其特征在于标记试剂为荧光色素； [12]上述[1] [11]中任一项记载的检测、定量方法，其特征在于使用逆转录酶作为具有 DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶；[13]上述[1] [12]中任一项记载的检测、定量方法，其 特征在于靶RNA为16SrRNA中的菌特异性RNA链；[14]使用上述[1] [13]中任一项记 载的RNA的检测、定量方法，对一种或多种病原微生物进行检测、定量的方法。本发明还涉及[15]RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于具有将含有靶RNA的 5’端靶特异性序列的引物的5’末端固定在基板表面制成的固相DNA⑴引物、在含有与靶
6RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列制成的 液相cDNA(-)引物、逆转录酶、RNA聚合酶、和特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链 的RNA分解酶；[16]上述[15]记载的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于液相cDNA(-)弓丨 物是通过标签序列，在含有与靶RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加 RNA聚合酶启动子序列制成的液相嵌合引物；[17]上述[15]或[16]记载的RNA的检测、定 量试剂盒，其特征在于还具有在标签序列的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列制成的液 相通用引物；[18]上述[16]或[17]记载的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于RNA聚合 酶启动子序列为标记的启动子序列；[19]上述[18]记载的RNA的检测、定量试剂盒，其特 征在于标记的启动子序列为生物素标记的启动子序列；[20]上述[15] [17]中任一项记 载的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于还含有标记试剂；[21]上述[20]记载的RNA的 检测、定量试剂盒，其特征在于标记试剂为荧光色素；[22]上述[15] [21]中任一项记载 的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于还含有DNA依赖性DNA聚合酶；[23]上述[15] [22]中任一项记载的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于靶RNA为16SrRNA中的菌特异性 RNA 链。根据由本发明开发出的核酸的定量方法，通过通用引物对核酸进行定量扩增，即 使在因核酸扩增中使用的引物而使核酸扩增的效率不同的情况下，也可以通过使用同一通 用引物对核酸进行扩增，使引物间的扩增效率均勻，因此可以通过核酸扩增进行定量解析。 这样，可以提供通过使用通用引物进行核酸扩增，不进行实时PCR就可以简便且定量地进 行检测的新微阵列技术。此外，即使在检测新病原菌时，也可以通过追加具有对该病原菌 特异的序列的固相引物来进行检测，因此与只能检测限定的菌种的以往的基因检测方法相 比，具有独创性和通用性。另外，根据本发明的核酸的定量方法，可以对检测出的信号进行 定量解析，因此对例如病症因感染量不同而不同的病原菌或多种病原菌的检测有效。特别 是还可以同时在短时间内准确地对多个耐药性基因进行检测、定量，因此开拓了构建新的 基因定量检测系统的道路。另外，使用本发明 的核酸定量方法的基因检测系统可以用作用 于对衣原体或立克次氏体等培养困难的病原微生物、耐药菌等医院内感染病原菌选择适当 的治疗方法的临床诊断用简易检验试剂。而且，本发明中基板使用了合成树脂，可以提供操 作简便并且可配合检测用设备进行加工的高通用性系统。


图1表示工序(a) (f)的示意图。(a)表示将固相DNA⑴引物2固定在基板1 的表面la。(b)和(c)表示在工序(d)中，将固相DNA⑴引物2固定在基板1的表面Ia 后开始上述反应的情况。(d)表示工序(e)中的反应的示意图。(e)表示工序(f)中的反 应的示意图。图2表示工序(g) (i)的示意图。(a)表示在工序(g)中，通过双链DNA6上存 在的启动子序列8合成单链RNA9，再使其与固相DNA(+)引物2杂交的反应的示意图。(b) 表示在工序(h)中，通过固相DNA⑴引物2合成cDNA链(+) 10，制成cDNA链-RNA链复合 体后、将该cDNA链-RNA链复合体的RNA链分解，得到单链DNA (+) 10的反应。(c)表示在 工序(i)中，使固相单链DNA⑴10与液相cDNA(-)引物或液相通用引物3b杂交，制备双链 DNA的反应的示意图。
图3是对扩增产物(RNA)进行定量检测的图。图4是为了确定最适引物量，对扩增后的DNA进行经时检测的图。横轴表示时间、 纵轴表示荧光强度。图5是对核酸扩增产物(DNA)进行定量、经时检测的图。图6中i)表示工序(d)中的在靶RNA的3’端杂交的液相嵌合引物；ii)表示通 过逆转录合成的cDNA链-RNA链复合体。iii)表示工序(e)中的反应的示意图。iv)表示 工序(f)中的反应的示意图。ν)表示在工序(g)中，反义RNA扩增的情况。vi)表示在工 序(g)中，扩增的反义RNA与固相DNA⑴引物杂交的情况。vii)表示工序(g)中的cDNA 链-RNA链复合体。viii)表示在工序(h)中，cDNA链-RNA链复合体的RNA链分解的情况。 ix)表示在工序(i)中，使单链DNA(+)与液相cDNA(-)引物或液相通用引物杂交的反应的 示意图。χ)表示工序⑴中的标记的双链DNA，还表示工序⑴后对工序(g)的单链RNA(-) 进行扩增的情况。
具体实施例方式作为本发明的靶RNA的检测、定量方法，只要是具有以下的(a) (j)的工序的方 法则没有特别限制，靶RNA是指成为鉴定和/或定量的对象的RNA，如后所述，可优选列举 16SrRNA中的菌特异性RNA链等。(a)将含有与靶RNA的5’端靶特异性序列相对应的DNA序列的引物的5’末端固 定在基板表面，制备固相DNA(+)引物的工序；(b)在含有与靶RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚 合酶启动子序列，制备液相cDNA(-)引物的工序；(b’ )根据需要，制备在标签序列的5’末端附加RNA聚合酶启动子序列的液相通 用引物的工序；(c)制备含有靶RNA的3’端序列和5’端靶特异性序列的试样RNA的工序；(d)使工序(b)中制备的液相cDNA(-)引物与工序(c)中制备的试样RNA链在液 相中接触，使液相cDNA(-)引物与试样RNA杂交，然后通过逆转录酶使DNA (-)链延长，制备 cDNA链-RNA链复合体的工序；(e)使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工序(d) 中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备单链DNA㈠的工序；(f)使工序(e)中制备的单链DNA(-)与工序(a)中制备的固相DNA⑴引物在液 相中接触，使单链DNA(-)与固相DNA⑴引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚合酶活 性的酶使DNA (+)链延长制备双链DNA的工序；(g)使RNA聚合酶作用于工序(f)中制备的双链DNA，利用来自DNA(-)链的RNA 聚合酶启动子序列使单链RNA(-)扩增，使扩增的单链RNA㈠与固相DNA⑴引物杂交，然 后通过逆转录酶使DNA (+)链延长制备cDNA链-RNA链复合体的工序；(h)使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工序(g) 中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备固相单链DNA⑴的工序；⑴使工序(h)中制备的固相单链DNA(+)与工序(b)中制备的液相cDNA(-)弓丨物 或工序(b’ )中制备的液相通用引物在液相中接触，使单链DNA⑴与液相cDNA(-)弓丨物或液相通用引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶使DNA (-)链延长，制备 双链DNA的工序；(j)对工序(f)和工序⑴中制备的双链DNA进行定量的工序；作为上述工序(C)中的试样，只要是含有微生物、动物、植物等的细胞或组织等的 RNA，例如，原核生物中的16SrRNA或23SrRNA、真核生物中的18SrRNA或28SrRNA等rRNA、 mRNA等RNA的试样则没有特别限制，另外，还含有细胞溶解液等生物体试样、由生物体试 样所得的培养物或由RNA扩增所得的合成RNA。其中，可优选列举已知基因的长度适当、 细胞内大量存在、序列的保守性高而另一方面也存在比较容易变异的部位的原核生物中的 16SrRNA、真核生物中的ISSrRNA。另外，作为上述微生物，除了难以确定病原菌的肺炎的病 原菌、MRSA之外，还可列举衣原体、立克次氏体等培养困难的病原微生物。此外，制备含有 靶RNA的5’端序列和3’端靶特异性序列的试样RNA是指，使用硫氰酸胍或市售试剂盒等 从试样中提取RNA、或者对提取出的RNA进行适当的切割处理，制备含有一个或多个靶RNA 的5’端序列和3’端靶特异性序列的RNA，但即使在不含这些靶RNA的情况下，为了方便起 见也包含在试样RNA的制备中。
作为上述工序(a)中的靶RNA的5’端靶特异性序列，只要是存在于靶RNA的5’ 端、可以将试样中所含的靶RNA与其它RNA区别开并进行检测、定量的靶RNA中的特异性 序列则没有特别限制，在选择所述靶RNA的5’端序列时，除可有效使用公知的数据库之 夕卜，还可以将成为检测对象的特定菌株的RNA作为模板，采用PCR法用引物进行扩增，用 市售的纯化柱(QIAGEN公司制)等将扩增片段纯化后，再用ABI PRIZM 377基因分析仪 (P. E. Biosystems公司制)等确定用4色染料终止子(dye terminator)法处理的序列，由 该序列信息选择靶RNA的5’端序列。作为靶RNA的5 ’端靶特异性序列，具体可列举序列表SEQ IDN0. 1表示的 以编码肺炎链球菌(Sti^ptococcus pneumoniae) 16SrRNA的基因区域的转录起始 部位作为1位时202位 223位的碱基序列、SEQ ID NO. 2表示的以编码流感杆菌 (Hemophilusinfluenzae) 16SrRNA的基因区域的转录起始部位作为1位时165位 187 位的碱基序列、SEQ ID NO. 3表示的以编码肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae) 16SrRNA 的基因区域的转录起始部位作为1位时1225位 1245位的碱基序列、SEQ ID N0. 4表 示的以编码肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae) 16SrRNA的基因区域的转录起始部位作 为1位时994位 1017位的碱基序列、SEQ ID N0. 5表示的以编码军团杆菌(Legionella spp.) 16SrRNA的基因区域的转录起始部位作为1位时436位 459位的碱基序列、SEQ ID N0. 6表示的以编码肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae) 16SrRNA的基因区域的转录 起始部位作为1位时52位 71位的碱基序列、SEQ ID N0. 7表示的以编码绿脓杆菌 (P. aereruginosae)16SrRNA的基因区域的转录起始部位作为1位时164位 185位的碱基 序列、SEQ ID N0. 8表示的以编码粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrahalis) 16SrRNA的基 因区域的转录起始部位作为1位时453位 473位的碱基序列，这些序列可适用于为了确 定肺炎病原菌而进行的检测。另外，与靶RNA的5’端靶特异性序列相对应的DNA序列是指，将靶RNA的5’端的 RNA序列中的U (尿嘧啶)改为T (胸腺嘧啶)的DNA序列。通过将含有与靶RNA的5，端靶 特异性序列相对应的DNA序列的引物的5’末端固定在基板表面，可以制备由固定有引物的基板构成的固相DNA⑴弓丨物。由于固相DNA⑴弓丨物中存在与靶RNA的5’端靶特异性序 列相对应的DNA序列，因此可以确定基板的部位特异性靶RNA，例如，使用具有多个孔的基 板时，#1孔中固定肺炎链球菌特异性序列、#2孔中固定流感杆菌特异性序列、#3孔中固定 肺炎支原体特异性序列，由每孔在工序(j)中的双链DNA的定量结果可以进行靶RNA的检 测、定量。这样，在独立的孔底面仅固定一种序列时，即使反应液(扩增试剂、嵌合引物、通 用引物、试样RNA的混合液)是共通的，基因扩增也仅在对应的孔内进行，可以进行靶RNA 的检测、定量。为了提高引物与基板表面的亲和性，还可以在上述引物的DNA序列的5’端导入接 头部，作为被导入的接头部，例如，当基板表面上具有活性酯基时，从可以提高与该活性酯 基的反应性、高效率且牢固地固定在基板的表面上的观点考虑，优选氨基。另外，作为基板 的材质，只要是不溶于水且可以结合引物的材质则没有特别限制，可以列举直链状聚烯烃 树脂、环状聚烯烃树脂、含氟树脂等，从耐化学药品性、低荧光性、透明性和成形性优异的观 点出发，优选使用环状烯烃。另外，作为基板的形状，只要是可以同时对多种核酸进行定量的形状 则没有特 别限制，例如可列举膜状、管状或板状的基板，具体可优选列举96孔等多孔板(multi plate)。当上述基板为多孔板状时，基板的表面优选通过微细加工形成微小多孔板用结构。 此时，在基板表面形成多个凹部，将回相引物固定在该凹部，从通过形成凹部可以高效率地 使工序(g)中合成的单链RNA(-)与固相DNA(+)引物杂交的观点出发优选。对于凹部，优 选形成深度为150 250 μ m、底部直径为0. 5 1. 5mm的孔。作为将引物固定在基板表面的方式，没有特别限制，例如可列举共价键、离子键、 物理吸附、使固相引物结合在凝胶中的方式等，例如可优选列举共价键，具体可列举当基 板表面存在包含具有由构成磷脂亲水部的磷酸酯衍生的基团的第一单元、以及具有羧酸衍 生基团的第二单元的高分子物质时，在所用的基板的表面，该高分子物质中所含的活性酯 基的一部分与5’端导入氨基作为接头的引物反应，在引物之间形成共价键的方法。此处， 第一单元起到抑制引物的非特异性吸附的作用，第二单元起到第二单元所含的羧酸衍生基 团将引物化学固定的作用，引物在包含该高分子物质的涂层的羧酸衍生基团部位形成共价 键，被固定在该基板的表面。通过共价键将固相引物固定时，为了使在工序(g)中利用来自DNA(-)链的RNA 聚合酶启动子序列生成的单链RNA(-)容易被固相DNA(+)引物捕捉，此外为了以固相引物 作为起点使工序(f)中制成的单链DNA(-)容易结合在固相DNA⑴弓丨物上，优选如图1(a) 所示将引物竖着固定，作为固定所述固相引物的方法，例如可列举通过溶解或分散有引物 的溶液将引物展开附着的方法，从可以使引物处于从孔内的基板表面突出的状态的观点考 虑，作为溶解或分散有引物的溶液的pH值，优选为中性至碱性，更优选pH为7. 6以上，具体 的可列举TE缓冲液(pH8. 0)等。另外，展开附着后，为了将未被固定在基板表面的引物除去，优选用纯水或缓冲液 等洗涤。洗涤后优选用碱化合物、或者具有伯氨基的化合物对除固定了引物之外的基板表 面的活性酯进行惰性处理，作为上述碱化合物，可以列举氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳 酸氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钙、氢氧化镁、硼酸钠、氢氧化锂、磷酸钾等，作为具有上述伯氨 基的化合物，例如可列举甘氨酸、9- T ^ y T ^ T > (9-aminoaquadine)、氨基丁醇、4-氨基丁酸、氨基辛酸、氨基乙醇、5-氨基2，3- 二氢-1，4-戊醇、氨基乙硫醇盐酸盐、氨基乙硫醇硫酸、2-(2_氨基乙氨基)乙醇、磷酸二氢2-氨基乙酯、硫酸氢氨基乙酯、4-(2_氨基 乙基)吗啉、5-氨基荧光素、6-氨基己酸、氨基己基纤维素、ρ-氨基马尿酸、2-氨基-2-羟甲 基-1，3-丙二醇、5-氨基间苯二甲酸、氨基甲烷、氨基苯酚、2-氨基辛烷、2-氨基辛酸、1-氨 基2-丙醇、3-氨基-1-丙醇、3-氨基丙烯、3-氨基丙腈、氨基吡啶、11-氨基十一酸、氨基水 杨酸、氨基喹啉、4-氨基邻苯二甲腈、3-氨基邻苯二甲酰亚胺、ρ-氨基苯丙酮、氨基苯乙酸、 氨基萘等。其中可列举氨基乙醇、甘氨酸。另外，为了切实地将本发明中所用的固相引物固定在基板上，更优选在洗涤后、于 75 85°C下加热1小时，加热处理后，照射120mJ/cm2的UV，由此进一步将引物固定。作为上述工序(b)中的靶RNA的3’端序列，只要是存在于靶RNA的3’端的序列 则没有特别限制，可以是3’端靶特异性序列，通过形成含有多种靶RNA所共有的序列(共 有保守区域等)的引物，在对多种靶RNA进行检测、定量时，可以使用共有液相嵌合引物等 液相cDNA(-)引物，其制作简便非常有利。例如，增加液相cDNA(-)引物的种类可能会引起 非特异性反应，因此优选尽可能选择试样中RNA序列的共有区域序列，例如选择用于检测、 定量的菌的16SrRNA序列的共有区域序列来设计液相cDNA(-)引物，具体可列举序列表 SEQ ID NO. 9表示的以编码肺炎链球菌、流感杆菌、军团杆菌、肺炎杆菌、绿脓杆菌、粘膜炎 莫拉菌16SrRNA的基因区域的转录起始部位作为1位时502位 519位的碱基序列、序列 表SEQ ID NO. 10表示的以编码肺炎支原体或肺炎衣原体16SrRNA的基因区域的转录起始 部位作为1位时1378位 1392位的碱基序列，这些序列可以在制备用于确定肺炎病原菌 的液相cDNA(-)引物时有效使用。另外，如果在含有与靶RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端附加 RNA聚合酶启动子序列则可以制备液相cDNA(-)引物，优选通过标签序列，在含有与靶RNA 的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列制成液相嵌 合引物。上述液相cDNA(-)引物、优选液相嵌合引物被用于工序(d)中，在工序(i)中适用 液相通用引物。液相通用引物不能在工序(d)中使用，而在工序(i)中使用液相通用引物 时，工序(b’ )成为必要工序，工序(b’ )中的液相通用引物可通过在标签序列的5’末端附 加RNA聚合酶启动子来制备。另外，液相通用引物中的RNA聚合酶启动子序列可以与液相 cDNA(-)引物中的RNA聚合酶启动子序列相同也可以不同。由于不具有靶RNA的3’端序列的液相通用引物具有共有序列(在标签序列的5’ 末端进一步附加RNA聚合酶启动子序列形成的序列)，因此无论靶RNA是否相同，都可以统 一因3’端序列的差异产生的不同的基因扩增效率。例如，如果将液相嵌合引物的混合量减 少至引起RNA扩增反应的限度，取而代之使液相通用引物的量增加，则扩增反应替换成只 有液相通用引物的反应，通过在启动子序列上结合RNA聚合酶使RNA扩增进行，从而可以统 一因3’端序列的差异产生的不同的基因扩增效率。因此，在工序(i)中使用液相通用引物 时，使液相通用引物的浓度达到液相嵌合引物等液相cDNA(-)引物浓度的10倍以上，例如 优选为10 100倍。作为上述液相嵌合引物或液相通用引物中的启动子序列，优选为存在可以通过该 启动子对RNA进行特异性扩增的RNA聚合酶的启动子序列，可以适当选择使用公知序列，例 如可列举，T7 聚合酶的启动子序列(5，-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3，) [SEQ ID NO. 11]、T3RNA 聚合酶的启动子序列(5，-TTATTAACCCTCACTAAAGGGAAG-3，)[SEQ ID NO. 12]、SP6RNA 聚合酶的启动子序列(5，-ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3‘ ) [SEQ ID NO. 13]等，其中从 RNA 扩增效率高的观点考虑，优选T7聚合酶的启动子序列。液相cDNA(-)引物可以按照常用 方法用DNA合成装置合成。另外，作为启动子序列可以有效利用标记的启动子序列，并可 以利用该标记简便地实施工序(j)中的双链DNA的检测、定量。作为用于所述标记的标记 物质，可以列举过氧化物酶(例如，辣根过氧化物酶horseradishperoxidase)、碱性磷酸 酯酶、β -D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、 青霉素酶、过氧化氢酶、脱辅葡萄糖氧化酶、脲酶、荧光素酶或者乙酰胆碱酯酶等酶；异硫氰 酸荧光素、藻胆蛋白、稀土金属螯合物、丹磺酰氯或四甲基若丹明异硫氰酸盐(f卜，^ ★ A 口一夕·笑 乂 手才〉了才、一卜，tetramethylrhodamine isothiocyanate)等荧光物
质；3H、14C、125I或131I等放射性同位素；生物素、亲和素、或者化学发光物质。例如，使用生 物素标记的启动子序列时，可以使用亲和素或者酶修饰亲和素进行定量。例如，使用链亲和 素_ β _半乳糖苷酶作为生物素的基质时，可以使用4-甲基-伞形酮基-β -D-半乳糖苷(4 -Methyl-umbelliferyl-^-D-galactoside)作为显色物质，另外，使用链亲和素-碱性磷 酸酯酶作为生物素的基质时，作为显色物质可以通过观察由5-溴-4-氯-3吲哚-磷酸与 氯化4-氮蓝四唑的相互作用而生成的蓝色不溶性化合物来进行定量。作为上述液相嵌合引物或液相通用引物中的标签序列，优选未与3’端序列或RNA 聚合酶启动子序列杂交的序列，包含1 20个碱基、优选包含5 15碱基，优选富含AG的 序列，具体的可列举在AGAAGG或AGAAGG中再附加富含AG的任意7个碱基形成的序列，例 如 AGAAGGAGCAGGA[SEQ ID NO. 14]等。本发明中，通过使用由固相DNA(+)引物和液相cDNA(-)引物构成的引物组而被 扩增的碱基对数量，可参考作为模板的核酸的碱基序列或所用的聚合酶的活性等来适当设 定，由于如果过长则扩增准确度可能会降低，故优选形成例如50 500碱基对长。以下，参照图1、图2和图6，对在工序(d)中使用液相嵌合引物、在工序(i)中使 用液相通用引物的靶RNA的检测、定量方法中的工序(d) (j)进行说明。图1、图2表示 在标记试剂的存在下使用无标记的液相通用引物的方法，图6表示使用标记的液相通用引 物的方法。从以下说明可知，工序⑷ 工序(j)可以在同一反应液中进行。工序(d)是使工序(b)中制备的液相嵌合引物与工序(C)中制备的试样RNA链 在液相中接触，使液相与试样RNA杂交，然后以试样中所含的RNA链为模板通过逆转录酶 将cDNA(-)链从5’端向3’端延长制备cDNA链-RNA链复合体的工序，例如可以在脱氧核 苷酸的存在下，通过使逆转录酶发挥作用，合成cDNA链-RNA链复合体。作为上述逆转录 酶，可以列举由AMV(Avian Myeloblastosys Virus)纯化而成的AMV逆转录酶、或者由表达 M-MLV(Molony MurineLeukemiaVirus)逆转录酶的重组体克隆的大肠菌纯化而成的M-MLV 逆转录酶等，优选使用具有比M-MLV逆转录酶高的延长活性、且活性温度高的AMV逆转录 酶。反应温度可参考所用的各种酶来适当决定，例如优选40°C 42°C。如图1(a)所示，在 基板1的表面Ia固定固相引物2后开始上述反应(参照图1(b)和(c)参照)。另外，图 6i)中表示在靶RNA的3’ 端杂交的液相嵌合引物，图6ii)中表示通过逆转录合成的cDNA 链-RNA链复合体。工序(e)是使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工序(d)中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备单链DNA㈠的工序，作为工序(e)中使用 的RNA分解酶，优选使用不会抑制RNA聚合酶活性、特异性分解DNA链-RNA链复合体中的 RNA链的RNA分解酶，具体的可优选列举RNaseH。反应的示意图如图1 (d)、图6iii)所示。工序(f)是使工序(e)中制备的单链DNA(-)与工序(a)中制备的固相DNA⑴弓丨 物在液相中接触，使单链DNA(-)与固相DNA⑴引物杂交，然后以单链DNA(-)为模板，通 过具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶使DNA⑴链从5，端向3，端延长制备双链DNA的 工序，例如可列举在脱氧核苷酸的存在下，使具有DNA聚合酶活性的酶反应，由此合成双链 cDNA的方法。作为上述具有DNA聚合酶活性的酶，必须是具有DNA依赖性DNA聚合酶活性 的酶，优选像5’ -或3’ -的外切核酸酶活性这样没有脱氧核糖核酸酶(DNase)活性的酶。 另夕卜，已经在上述工序⑷中使用像上述AMV逆转录酶这样兼具DNA依赖性DNA聚合酶活 性的酶时，不需要添加具有DNA聚合酶活性的酶。反应的示意图如图1(e)、图6iv)所示。工序(g)是使RNA聚合酶作用于工序(f)中制备的双链DNA，利用来自DNA(-)链 的RNA聚合酶启动子序列，使单链RNA (-)、即反义RNA扩增，使扩增的单链RNA (-)的3 ’端 与固相DNA(+)引物杂交，然后在脱氧核苷酸的存在下，通过逆转录酶使DNA(+)链延长制备 cDNA链-RNA链复合体的工序，图2 (a)中表示了通过存在于双链cDNA6上的启动子序列8 合成单链RNA9，与固相DNA⑴引物2杂交的反应的示意图，另外，图6iv)和ν)中表示反义 RNA扩增的情况，图6vi)中表示扩增的反义RNA与固相DNA(+)引物杂交的情况，图6vii) 中表示cDNA链-RNA链复合体。工序(h)是使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工 序(g)中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备固相单链DNA⑴的工序，作为上述RNA分解 酶可优选列举上述RNaseH。图2 (b)中表示了通过固相DNA (+)引物2合成cDNA链(+) 10， 制备cDNA链-RNA链复合体后，使该cDNA链-RNA链复合体的RNA链分解，得到单链cDNAlO 的反应，另外，图6viii)中表示cDNA链-RNA链复合体的RNA链分解的情况。工序⑴是使工序(h)中制备的固相单链DNA(+)与工序(b’)中制备的液相通用 引物在液相中接触，使单链DNA⑴与液相通用引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚 合酶活性的酶使DNA(-)链和DNA⑴链分别从5，向3，端延长，制备双链DNA的工序，作为 上述酶可以直接利用工序(f)中使用的酶。该工序(i)中，通过使液相通用引物的量增加 至与工序(d)的液相嵌合引物相比10倍以上，以扩增反应替换成只有液相通用引物的反应 并同时扩增多种基因为目的时，所有液相嵌合引物替换成了通用引物而可以实现具有定量 性的反应。图2 (c)中表示使cDNA链10与液相引物3b杂交的反应，另外图6ix)中表示单 链DNA⑴与标记的液相通用引物杂交的情况，图6x)中表示标记的双链DNA。将上述工序(g) 工序(i)重复两次以上在提高定量准确度方面优选，如上所述， 由于工序(d) 工序(i)在同一反应液中进行，因此通过调节反应时间等反应条件，不需要 特别操作而是将工序(g) 工序(i)重复两次以上。图6x)中表示工序(i)后对工序(g) 的单链RNA(-)和DNA⑴链进行扩增的情况。工序(j)是对工序(f)和工序(i)中制备的双链DNA进行定量的工序，作为对合 成的双链DNA进行检测、定量的方法不特别限定，可以列举向反应液中加入标记双链DNA 的标记试剂的方法、预先标记脱氧核 苷酸的方法、标记液相通用引物或液相嵌合引物中的 引物序列的方法等公知方法。另外，还可以通过实时PCR等，对用于定量的荧光色素的荧光量进行经时测定。通过累积由此所得的测定值，可以对所得的DNA扩增产物进行定量。作为上述标记试剂，可以使用标记双链DNA的公知试剂，例如可列举荧光色素或 显色试剂。具体的而言，例如可列举作为嵌入双链DNA间的嵌入剂的SYBER Green (
八^才社制)。例如，通过向反应溶液中加入SYBER Green，在基板上形成双链DNA时可以 嵌入SYBER Green，简便地进行标记。使用SYBER Green作为标记试剂时，优选使用微阵列、 扫描仪，在485nm的激发光下，对525nm的荧光进行经时观察。另外，还可以使用嵌入双链 DNA间的溴化乙锭，在UV下显色检测双链DNA。另外，作为预先标记脱氧核苷酸的方法，例如可列举通过FITC或若丹明 (rhodamine)、Cy3或Cy5等花青等的荧光色素标记的方法，进一步地，可列举用生物素、洋 地黄毒苷或RI等标记，用碱性磷酸酯酶或过氧化物酶等显色试剂显色的方法。这些经标记 的脱氧核苷酸用于形成基板上的双链DNA，因此可以简便地对形成的双链DNA进行标记。例 如，使用生物素标记dUTP对双链DNA进行检测、定量时，优选在各反应溶液中使用[表1] 所示的用于生物素标记的酶反应溶液、以及[表2]所示的用于进行Cy3标记反应的试剂， 于37°C下反应15分钟。[表 1] __ 终浓度
ΙΟμΜ dATP8μΕ~ ΙμΜ
ΙΟμΜ dGTP8μ ΙμΜ
ΙΟμΜ dCTPΙμΜ
ΙΟμΜ 生物素-dUTPΙμΜIOx Ex Taq 缓冲液Ix
IOx MPEX 缓冲液 AIx
去离子水23.2pL -
试样 DNA1/10
TaKaRa Ex Tag__0.8μ __-
合计80μ 反应中需要70 μ L/片[表 2]
_JS记终浓度
Ο.ΟΙμβ/μΕ 链霉素-Cy3 8μ Ing/pL 「QQ77l1/100 链霉素-AP-1/1000
IOx MPEX 缓冲液 A8μ Ix
2χ MPEX 缓冲液 B40μ Ix
去离子水__24pL__-
合计~80μΕ反应中需要70 μ L/片在上述工序(d) (j)中，可以在每个工序中添加上述记载的酶等，更优选预先将 所有工序中所需的试剂作为同一反应溶液进行制备，导入基板上。如上所述，重复进行上述 工序(g) (i)合成双链DNA，每次重复，不需要重新向反应系统中添加RNA分解酶、DNA聚 合酶等酶，可以迅速且简单地进行DNA片段的复制、扩增。并且，在基板上导入反应溶液时， 优选将可以完全覆盖设置在基板上的多个凹部的盖子覆盖在基板上，通过表面张力将反应 溶液导入各凹部。另外，通过使用盖子，不仅节省了分注反应溶液的工时，而且可以抑制污染、减少反应溶液的总量，实现低成本化。此外该盖子优选为透明的以使标记试剂的检测容 易进行。通过本发明的靶RNA的检测、定量方法，即使用微量的试样RNA也可以对形成在基 板上的双链DNA进行定量，从而可以简便地在同一基板上对单一或多种靶RNA进行定量。 另外，在采用本发明的靶RNA的检测、定量方法，对一种或多种病原微生物进行检测、定量 的情况下，检测时不需要培养，因此特别是可以简便且迅速地对用常用方法无法培养的微 生物等进行检测，所以在检测来自病原微生物的RNA时也有效，并且，可以简便地进行多重 化，因而可以简便地用一个试样一次对来自多种病原微生物的RNA进行定量。作为本发明的RNA的检测、定量试剂盒，只要是具有将含有靶RNA的5’端靶特异性 序列的引物的5’末端固定在基板表面制成的固相DNA⑴引物、在含有与靶RNA的3’端序 列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列制成的液相cDNA(-)引 物、逆转录酶、RNA聚合酶、特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶的试 剂盒则没有特别限制，上述液相cDNA(-)引物优选为通过标签序列在含有与靶RNA的3’端 序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列制成的液相嵌合引物， 并且，优选具有在标签序列的5’末端附加RNA聚合酶启动子序列的液相通用引物。另外， 上述引物序列优选为生物素标记的启动子序列等标记的启动子序列、或者含有荧光色素等 标记试剂的序列。还可以含有DNA依赖性DNA聚合酶。如果使用本发明的RNA的检测、定 量试剂盒，则可以简便且迅速地对16SrRNA中的菌特异性RNA链等靶RNA进行检测、定量。以下、通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不仅限于以下实施例。(参考例1)使用液相通用弓I物的靶RNA的定量检测进行NASBA法，讨论具有靶RNA序列的RNA的定量是否可以进行。使用从 H. influenzae提取的RNA作为靶RNA，使用包含20个碱基对的聚T序列作为阴性对照。 另夕卜，作为靶RNA的引物，正向引物使用具有与H. influenzae的16SrRNA基因的165 位 187位碱基序列相同碱基序列的DNA。此外，作为反向引物，使用在具有与16SrRNA 基因的502位 519位碱基序列互补的碱基序列的5’端附加包含13碱基的标签序列 (AGAAGGAGCAGGA)、再在标签序列的5’端附加启动子序列形成的引物。对于该启动子序列， 使用T7RNA聚合酶的启动子序列(5’ -TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3’)。作为通用引物，使 用在包含13碱基的标签序列(AGAAGGAGCAGGA)的5’端附加T7RNA聚合酶的启动子序列形 成的引物。首先，在管表面涂布具有活性酯的聚合物，作为固相引物，使其具有与导入正向 引物5’末端的氨基结合的功能。然后，将H. influenzae的提取RNA悬浮在缓冲液(50mM Tris-HCl，ρΗ8· 3、6mM MgCl2、40mM KCl)中，分别制备含有该 RNA104、ΙΟ5、ΙΟ6、ΙΟ7、108、IO9 拷 贝的溶液。在NASBA试剂专用Master Mix 10 μ 1 (Biomeru公司制)中混合0.05 μ M本发 明的液相嵌合引物、2 μ M本发明的液相通用引物、以及SYBER Green (夕力，社制)1000pg， 95 °C下加热30秒。然后， 在65 °C下静置5分钟，制备提取RNA溶液。然后，向上述提取RNA 溶液中添加5μ 1的IOmM DTT、40单位AMV逆转录酶、0. 4单位RNaseH、20单位T7RNA聚合酶 的酶混合液(Biomeru公司制)，制备终容量为20 μ 1的反应溶液。然后，在设定为41°C的恒 温槽中设置各管，通过NASBA法扩增RNA。接着为了确认通过NASBA法扩增的H. influenzae的RNA是否被定量扩增，进行扩增产物(RNA)的电泳来确认。其结果如图3所示。图3中， 横轴表示碱基数、纵轴表示荧光强度。从图3中观察到随着作为模板的基因组的拷贝数增 力口，RNA扩增产物(368nt)的荧光强度也增加。即，可以确认靶RNA被定量扩增。(参考例2)固相DNA(+)引物的最适固定量接着为了讨论固相DNA⑴引物应该固定的量，使对应于H. influenzae的固相引 物的量为1.2511|1、2.511|1、511|1、1(^11，溶解于固定用的点样溶液(住友《'一々，^卜社 制)、取 μ 滴加到各管中。滴加后，将各管在80°C下保温1小时，将其作为检测用管。然 后，制备使用IO8拷贝的H. influenzae的提取RNA和上述检测用管的反应溶液，通过NASBA 法对RNA进行扩增。另外，使用包含20个碱基对的聚T序列作为阴性对照。RNA扩增时， 经60分钟测定每1份在485nm的激发光下525nm的荧光，并对扩增的DNA进行经时检测， 确定最适引物的量。其结果如图4所示。图4中，横轴表示时间、纵轴表示荧光强度。从图 4中观察到固定在管内的引物的量为1.25 μ M时，靶核酸的扩增效率最佳。实施例1靶RNA的定量检测然后，采用与参考例1相同的方式制备含有H. influenzae的提取核酸(RNA) 103、 ΙΟ4、ΙΟ5、106、IO7拷贝的试样RNA溶液。将该RNA提取溶液加入到结合了 1. 25 μ M固相DNA(+) 引物的各管中，与参考例1同样地，通过NASBA法对核酸进行扩增。另外，使用包含20个碱 基对的聚T序列作为阴性对照。核酸扩增时，经60分钟测定每1份在485nm的激发光下 525nm的荧光，并对扩增的DNA进行经时检测。其结果如图5所示。图5中，图谱的纵轴表 示荧光强度，横轴表示反应时间。图5中，用各曲线的积分值表示由NASBA法得到的核酸扩 增产物(DNA)的总量。伴随着提取RNA的拷贝数增加，观察到核酸扩增产物的量也增加，还 观察到在固定了固相DNA(+)引物的管中可以对具有靶特异性序列的RNA进行定量。实施例2[多种病原菌的检测、定量]对于被认为患有肺炎的患者，为了对引起肺炎的菌进行检测、定量，使用本发明的 靶RNA的检测、定量方法。(固相引物的制备)将序列表中SEQ ID NO. 1表示的肺炎链球菌特异性碱基序列(#1)、SEQ ID NO. 2表 示的流感杆菌特异性碱基序列(#2)、SEQ ID NO. 3表示的肺炎支原体特异性碱基序列(#3)、 SEQ ID NO. 4表示的肺炎衣原体菌株特异性碱基序列(#4)、SEQ ID NO. 5表示的军团杆菌特 异性碱基序列(#5)、SEQ ID NO. 6表示的肺炎杆菌特异性碱基序列(#6)、SEQ ID NO. 7表示 的绿脓杆菌特异性碱基序列(#7)、以及SEQ ID N0. 8表示的粘膜炎莫拉菌特异性碱基序列 (#8)作为具有与靶RNA的5’端靶特异性序列相对应DNA序列的引物，通过常用方法制作在 其5’末端导入氨基的引物，使用该引物制备固相DNA(+)引物。基板使用96孔的多孔板， 将上述8种的各引物溶解于固定用的点样溶液中，制备0. 5 μ M浓度的DNA引物溶液。每种 弓丨物分配12个孔，将各引物溶液分别滴加到12个孔内后于80°C保温1小时，将8种各引物 分别固定在12个孔内，作为#1 #8的多重固相DNA⑴弓丨物。
(液相嵌合引物的制备)
作为液相嵌合引物，将序列表中SEQ ID NO. 9表示的肺炎链球菌、流感杆菌、军团 杆菌、肺炎杆菌、绿脓杆菌、粘膜炎莫拉菌等菌特异性碱基序列，序列表中SEQ ID NO. 10表 示的肺炎支原体、或者肺炎衣原体等菌特异性碱基序列作为靶RNA的3’端序列，在含有与 它们互补的cDNA序列的引物的5，末端，附加SEQ ID NO. 14表示的标签序列，再在标签序 列的5’末端附加SEQ ID NO. 11表示的T7聚合酶的生物素标记的启动子序列，制备液相嵌 合引物。(液相通用引物的制备)作为液相通用引物，在SEQ ID NO. 14表示的标签序列的5，末端附加SEQ ID NO. 11 表示的T7聚合酶的生物素标记的启动子序列，制备液相通用引物。然后，将流感杆菌、肺炎支原体和粘膜炎莫拉菌的RNA提取液悬浮在缓冲液(50mM Tris-HCl，ρΗ8· 3、6mM MgCl2、40mM KCl)中，分别制备含有该 RNA104、ΙΟ5、ΙΟ6、ΙΟ7、108、IO9 拷 贝的溶液。在NASBA试剂专用Master Mix 10 μ 1 (Biomeru公司制)中混合0. 05 μ M液相 嵌合引物、2 μ M液相通用引物，95°C下加热30秒。然后，在65°C下静置5分钟，向上述提取 RNA溶液中添加5 μ 1的IOmM DTT、40单位AMV逆转录酶、0. 4单位RNaseH、20单位T7RNA聚 合酶的酶混合液(Biomeru公司制)，制备终容量为20 μ 1的反应溶液。然后，在设定为41°C 的恒温槽中设置基板使反应进行。反应开始后，每1份12分钟依次使各反应停止，在#1 #8的各终反应液中使用链亲和素_碱性磷酸酯酶作为生物素的基质，使用5-溴-4-氯-3 吲哚_磷酸和氯化4-氮蓝四唑作为显色物质进行显色反应，观察蓝色。
权利要求
靶RNA的检测、定量方法，其特征在于包括以下的(a)～(j)的工序(a)将含有与靶RNA的5’端靶特异性序列相对应的DNA序列的引物的5’末端固定在基板表面，制备固相DNA(+)引物的工序；(b)在含有与靶RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列，制备液相cDNA(-)引物的工序；(b’)根据需要，制备在标签序列的5’末端附加RNA聚合酶启动子序列的液相通用引物的工序；(c)制备含有靶RNA的3’端序列和5’端靶特异性序列的试样RNA的工序；(d)使工序(b)中制备的液相cDNA(-)引物与工序(c)中制备的试样RNA链在液相中接触，使液相cDNA(-)引物与试样RNA杂交，然后通过逆转录酶使DNA(-)链延长，制备cDNA链-RNA链复合体的工序；(e)使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工序(d)中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备单链DNA(-)的工序；(f)使工序(e)中制备的单链DNA(-)与工序(a)中制备的固相DNA(+)引物在液相中接触，使单链DNA(-)与固相DNA(+)引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶使DNA(+)链延长制备双链DNA的工序；(g)使RNA聚合酶作用于工序(f)中制备的双链DNA，利用来自DNA(-)链的RNA聚合酶启动子序列使单链RNA(-)扩增，使扩增的单链RNA(-)与固相DNA(+)引物杂交，然后通过逆转录酶使DNA(+)链延长制备cDNA链-RNA链复合体的工序；(h)使特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶作用于工序(g)中制备的cDNA链-RNA链复合体，制备固相单链DNA(+)的工序；(i)使工序(h)中制备的固相单链DNA(+)与工序(b)中制备的液相cDNA(-)引物或工序(b’)中制备的液相通用引物在液相中接触，使单链DNA(+)与液相cDNA(-)引物或液相通用引物杂交，然后通过具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶使DNA(-)链延长，制备双链DNA的工序；(j)对工序(f)和工序(i)中制备的双链DNA进行定量的工序。
2.如权利要求1所述的检测、定量方法，其特征在于重复两次以上工序(g) 工序⑴。
3.如权利要求1或2所述的检测、定量方法，其特征在于在同一反应液中进行工序 (d) 工序(j)。
4.如权利要求1 3中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于在同一基板上对多 个靶RNA进行检测、定量。
5.如权利要求1 4中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于在工序(i)中使用 液相通用引物。
6.如权利要求5所述的检测、定量方法，其特征在于液相通用引物的浓度为液相 cDNA㈠引物浓度的10倍以上。
7.如权利要求1 6中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于液相cDNA㈠弓丨物 是通过标签序列，在含有与靶RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附加 RNA聚合酶启动子序列制成的液相嵌合引物。
8.如权利要求1 7中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于使用RNA聚合酶启 动子序列是标记的启动子序列的液相通用引物或液相嵌合引物。
9.如权利要求8所述的检测、定量方法，其特征在于标记的启动子序列是生物素标记 的启动子序列。
10.如权利要求1 7中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于在标记试剂的存 在下进行工序(i)。
11.如权利要求10所述的RNA的检测、定量方法，其特征在于标记试剂为荧光色素。
12.如权利要求1 11中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于使用逆转录酶作 为具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶。
13.如权利要求1 12中任一项所述的检测、定量方法，其特征在于靶RNA为16SrRNA 中的菌特异性RNA链。
14.使用权利要求1 13中任一项所述的RNA的检测、定量方法，对一种或多种病原微 生物进行检测、定量的方法。
15.RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于具有将含有靶RNA的5’端靶特异性序列的 引物的5’末端固定在基板表面制成的固相DNA⑴引物、在含有与靶RNA的3’端序列互补 的cDNA序列的引物的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列制成的液相cDNA㈠引物、逆 转录酶、RNA聚合酶、特异性分解DNA链-RNA链复合体中的RNA链的RNA分解酶。
16.如权利要求15所述的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于液相cDNA(-)引物是 通过标签序列，在含有与靶RNA的3’端序列互补的cDNA序列的引物的5’末端侧附RNA聚 合酶启动子序列制成的液相嵌合引物。
17.如权利要求15或16所述的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于还具有在标签 序列的5’末端侧附加RNA聚合酶启动子序列制成的液相通用引物。
18.如权利要求16或17所述的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于RNA聚合酶启动 子序列为标记的启动子序列。
19.如权利要求18所述的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于标记的启动子序列为 生物素标记的启动子序列。
20.如权利要求15 17中任一项所述的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于还含 有标记试剂。
21.如权利要求20所述的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于标记试剂为荧光色素。
22.如权利要求15 21中任一项所述的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于还含 有DNA依赖性DNA聚合酶。
23.如权利要求15 22中任一项所述的RNA的检测、定量试剂盒，其特征在于靶RNA 为16SrRNA中的菌特异性RNA链。
全文摘要
提供在对一种或多种病原微生物进行检测、定量等情况下，可以从试样中微量的RNA中简便且迅速地检测、定量靶RNA的方法或试剂盒。1)使用具有启动子序列的液相引物和逆转录酶，由含有靶RNA的试样合成cDNA，得到cDNA-RNA复合体；2)分解该复合体的RNA；3)通过上述2)得到的cDNA和上述固相引物，合成双链DNA；4)由该双链DNA合成RNA；5)通过上述4)得到的RNA和上述固相引物合成cDNA，得到cDNA-RNA复合体；6)分解上述5)得到的复合体的RNA；7)通过上述6)得到的cDNA和上述液相引物，合成双链DNA；8)对上述3)和7)得到的双链DNA进行定量。该方法可以在同一反应液中进行。
文档编号C12Q1/68GK101835905SQ20088011305
公开日2010年9月15日 申请日期2008年11月4日 优先权日2007年11月1日
发明者横山兼久, 白井睦训, 福永肇, 藤原一彦, 藤本健太郎 申请人:国立大学法人山口大学