一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 根据国际前列腺炎合作网1998年提出的前列腺炎分类方法，前列腺炎共分为四 型。I型：急性细菌性前列腺炎，指前列腺急性细菌感染；II型：慢性细菌性前列腺炎，指前 列腺慢性复发性细菌感染；III型：慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合症（CP/CPPS)，其定义 为病史在3个月以上，骨盆区疼痛或不适，不同程度的排尿或性交时不适，此型根据前列腺 按摩液、精液中白细胞计数又分为炎症性和非炎症性两种亚型；IV型无临床炎症性前列腺 炎，没有症状，只是在病理检查或检查其他症状时发现前列腺按摩液中存在白细胞才偶然 被诊断。其中I型、II型患者数量少，IV型前列腺炎因无任何症状，勿须处理，亦无重要临床 意义。只有III型前列腺炎患者因常规检查及培养未能发现明确的病原体，病因不明，发病机 制不清，不能进行针对性治疗，临床疗效差，而且患者数量占临床慢性前列腺炎患者的60% 以上。
[0003] 研宄发现纳米细菌能分泌钙化脂多糖生物膜，具有较强的毒性。人体内感染的纳 米细菌，主要经泌尿系统排出体外。排尿时尿道高压可引起尿液返流进入前列腺导管和腺 胞内，在此过程中，尿液中的纳米细菌容易被伴随转移，进入到前列腺内，这可能在纳米细 菌感染前列腺过程中发挥主要和积极的作用。此外，前列腺导管细长、弯曲、开口处口径小， 与尿道成直角或斜行向上进入尿道，也有利于尿道病原体进入腺体，不利于腺体炎性渗出 物排除和引流，病原体可长期寄生在其中。以上诸多因素为纳米细菌在前列腺内感染和致 病提供了条件和可能。
[0004] 关于纳米细菌与III型前列腺炎和前列腺结石可能存在的病因学关系，目前国内外 只有少数学者在临床方面进行了探索。Jones等最初研宄结果显示，前列腺炎患者血清中 纳米细菌抗原经过ELISA分析检出率显著高于正常男性及前列腺增生患者。Shoke等通过 对顽固性III型前列腺炎伴结石患者用四环素抗纳米细菌治疗后，发现患者临床症状显著改 善，结石变小或消失；还有人分别从III型前列腺炎患者的EPS及前列腺结石中分离、培养出 纳米细菌细菌，并发现其中纳米细菌具有较高感染率，分别达62. 5%、65%。在针对性治疗 后，EPS中纳米细菌阳性率明显下降。因此推断纳米细菌与III型前列腺炎和前列腺结石之 间存在着较密切关系，考虑为其重要病因。
【发明内容】
[0005] 本发明实施例的目的在于提供一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法，旨在为研 宄纳米细菌与III型前列腺炎和前列腺结石之间可能存在的病因关系收集收集病原菌，更好 地用于指导临床工作，减轻病患的身心痛苦和经济负担，节约更多的医疗资源。
[0006] 本发明是这样实现的，一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法包括：
[0007] 步骤一、EPS标本的采集：
[0008] 消毒尿道外口，无菌操作取5ml初段尿记为VBl ;排出约50?IOOml尿液后再取 5ml中段尿记为VB2 ;行经直肠前列腺按摩，无菌操作取1?2ml EPS，最后残留于尿道外口 的1滴EPS涂于玻片上，行常规镜检；重新消毒尿道外口，取5ml按摩后初段尿记为VB3 ;
[0009] 步骤二、EPS标本的处理：
[0010] 分别取VB1、VB2、VB3、EPSlml，用生理盐水稀释5倍，经0. 45 μπι滤器过滤，4°C 离心40min (20, OOOXg)，弃上清，留取管底Iml充分混勾，再用无菌生理盐水稀释5倍，经 0. 22 μ m滤器过滤，4°C离心40min (20,000 Xg)，弃上清，留取管底Iml充分混匀；
[0011] 步骤三、结石标本的处理：
[0012] 手术中无菌采取患者的结石标本，在IN HCl中浸泡30min，以去除矿物质，加入 IM Tris进行中和，碾碎结石，用生理盐水配成5 %浓度，用0. 22 μ m滤膜过滤，4°C离心 40min (20000 Xg)；
[0013] 步骤四、标本的培养：
[0014] 在步骤三所得述滤液中加入3?4ml含10% γ -FBS的RPMI1640培养基，在37°C、 pH7. 4、5% 0)2和95%空气条件下培养，每周观察并记录纳米细菌的生长情况；
[0015] 步骤五、间接免疫荧光染色，荧光显微镜观察：
[0016] 步骤三所得培养液4°C离心30min(20,000Xg)，弃上清，留取底部0. 5ml充分混 匀，取1滴到玻片上，自然晾干，4 %多聚甲醛固定15min，水洗后在70°C烤IOmin，滴加一抗， 37°C孵育 60min，PH7. 4 的 PBS 冲洗 2minX3 次，滴加二抗，37°C 孵育 40min，PH7. 4 的 PBS 冲洗2minX 3次，80%甘油封片，置于荧光显微镜下观察，用PBS替代8D10抗体作为阴性对 昭.
[0017] 步骤六、透射电镜扫描（负染法）：
[0018] 步骤三所得培养液4°C (20,000 Xg)，离心30分钟后弃上清，沉淀用2. 5 %的戊二 醛固定，细菌稀释液滴在有膜的铜网上，静置数分钟后，用滤纸尖吸掉，用3%磷钨酸染色 1?2min，置于PHILPS TECNAI10透射电镜下观察照相，工作电压80kV ;
[0019] 步骤七、超薄切片观察：
[0020] 步骤三所得培养液4°C (20,000Xg)，离心30分钟后弃上清，沉淀用2. 5%戊二醛 固定1小时，0.1111〇1/1磷酸钠缓冲液（?85)10分钟，1%四氧化锇1小时，0.1111〇1/1?8510分 钟，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，用钻石刀进行超薄切片，切片置于200目有膜铜网上，将 铜网浮于10%经培养证实不含纳米细菌γ -FBS滴上，双蒸水洗3分钟X 3次，5%醋酸铀染 色5分钟，双蒸水洗3分钟X 3次，构椽酸铅染色5分钟，双蒸水充分洗涤，干燥后在PHILPS TECNAI10透射电镜下观察照相，工作电压80kV ;
[0021] 步骤八、扫描电镜观察：
[0022] 步骤三所得培养液4°C (20, 000 X g)，离心30分钟后弃上清，沉淀物PBS洗2遍， 每次3分钟，沉淀物入六孔培养板，将无菌盖玻片置入培养72小时，PBS洗2遍，每次3分 钟，2. 5 %戊二醛固定1小时，梯度乙醇脱水，冷冻干燥，金属镀膜，置于KYKY-EM3200扫描电 镜下观察，工作电压30kV ;
[0023] 步骤九、Dahl McGec-Russel氏茜素红染色：
[0024] 取培养标本涂片固定，蒸馏水冲洗3遍，每遍2min ;2%茜素红2S染液染2?5min， 蒸馏水速洗；0. 2%淡绿水溶液复染20?30s，0. 5%醋酸水溶液速洗；95%乙醇和100%乙 醇脱水，烘干后用二甲苯透明中性树胶封固，油镜观察；
[0025] 步骤十、结果判定标准：
[0026] 通过电镜观察可见纳米细菌呈球状或球杆状，大小约100?500nm，菌体周围有一 层黑色的物质包绕；单克隆抗体间接免疫荧光染色可见阳性标本在高倍视野中呈绿色的杆 状或球状颗粒分布，钙染色纳米细菌绝大多数聚集成簇，呈革兰阴性。
[0027] 进一步，步骤三所述的标本的培养，分别用不加标本的RPMI 1640、不加标本的含 10% γ-FBS的RPMI 1640、生理盐水加 RPMI 1640进行阴性对照培养。
【附图说明】
[0028] 图1是本发明实施例提供的纳米细菌的培养与形态学鉴定方法流程图。
【具体实施方式】
[0029] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0030] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0031] 本发明实施例的对象选择：
[0032] 1.选择2008年9月-2009年1月在第三军医大学西南医院门诊就诊的III型前列 腺炎患者，根据病史、前列腺按摩前后尿液常规细菌培养、EPS常规镜检的结果筛选出55例 作为实验对象（参照美国NIH1998年前列腺炎分类标准）。年龄26?48岁，平均36岁。 病程6?48个月。健康成年男性40例作为正常对照。年龄21?43岁，平均年龄30岁。 无前列腺炎或尿路感染史，前列腺按摩前后尿液细菌学培养均为阴性，EPS中WBC < 10个/ HP，卵磷脂小体彡+++/HP。
[0033] 2.选择2008年9月?2009年1月在第三军医大学西南医院泌尿外科住院的前列 腺增生伴前列腺结石患者，根据病史、X线、B超检查结果筛选出30例，年龄40?62岁，平 均51岁。手术中无菌采集前列腺结石患者的结石标本。
[0034] 如图1所示，一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法包括：
[0035] SlOl :无菌操作取初段尿记为VB1、中段尿记为VB2、EPS、按摩后初段尿记为VB3 ;
[0036] S102 :EPS标本的处理；
[0037] S103 :结石标本的处理；
[0038] S104 :标本的培养；
[0039] S105 :间接免疫荧光染色，荧光显微镜观察；
[0040] S106 :透射电镜扫描；
[0041] S107:超薄切片观察；
[0042] S108:扫描电镜观察；
[0043] S109 :Dahl McGec-Russel 氏茜素红染色；
[0044] S110:结果判定标准。
[0045] 具体步骤如下：
[0046] 步骤一、EPS标本的采集：
[0047] 用新洁尔灭消毒尿道外口，无菌操作取5ml初段尿记为VBl ;排出约50?IOOml尿 液后再取5ml中段尿记为VB2 ;行经直肠前列腺按摩，无菌操作取1?2ml EPS，最后残留于 尿道外口的1滴EPS涂于玻片上，行常规镜检；重新用新洁尔灭消毒尿道外口，取5ml按摩 后初段尿记为VB3 ;
[0048] 步骤二、EPS标本的处理：
[0049] 分别取VB1、VB2、VB3、EPSlml，用生