一种测定抑制骨吸收药物生物活性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及测定骨吸收药物活性的方法，具体涉及抑制破骨细胞分化和骨吸收活 性的药物的活性测定方法。
【背景技术】
[0002] 骨质疏松症是常见的骨吸收疾病，随着世界人口老龄化日趋明显，骨质疏松症的 发病率逐年升高，由骨质疏松症所致的骨痛和骨折直接影响了中老年人的生存质量，已成 严峻的社会问题。
[0003] 骨质疏松症是由于骨代谢失衡导致骨吸收增加而引起的骨代谢性疾病，所以抑制 骨吸收是治疗骨质疏松症的有效途径。在人体里，破骨细胞是唯一具有骨吸收功能的细胞， 破骨细胞的分化或其功能的改变所导致的骨改建失衡是骨质疏松的重要病理基础。也就是 说，开发抑制破骨细胞分化和骨吸收能力的药物是防治骨质疏松症的主要药理基础。
[0004] 破骨细胞来源于骨髓造血干细胞，由单个核前体细胞融合而成，主要分布在主要 分布在骨质表面、骨内血管通道周围。成熟破骨细胞是含有2-50个紧密堆积的核的巨大细 胞，具有较强的骨吸收能力，在体外培养的破骨细胞可以在骨片或象牙表面上形成骨吸收 陷窝。
[0005] 在体外成功诱导破骨细胞培养体系是开发抑制骨吸收药物的关键。目前，，破骨细 胞的培养方法主要有原代培养方法和骨髓诱导培养方法。其中原代培养方法得到的破骨 细胞数量少，且得到的细胞大多为成熟破骨细胞，不适合用于破骨细胞增殖、分化方面的研 究。骨髓诱导培养方法，虽然得到充足的破骨细胞来源，但目前的培养方法得到的破骨细胞 具有其性质与体内原有破骨细胞有差异，具有噬骨能力差等缺点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供简单、有效测定抑制骨吸收药物生物活性的方法。
[0007] 本发明的技术方案为如下：
[0008] -种测定抑制骨吸收药物生物活性的方法，在体外诱导的破骨细胞培养体系中， 加入不同浓度的待测药物，测定破骨细胞功能。
[0009] 本发明的技术方案中，所述体外诱导的破骨细胞培养体系是大鼠骨髓源性细胞诱 导的培养体系。
[0010] 本发明的技术方案中，所述破骨细胞功能包括抗酒石酸酸性磷酸酶染色活性和在 象牙片上骨吸收活性。
[0011] 本发明的技术方案中，所述体外诱导的破骨细胞培养体系，通过如下方法获得；
[0012] (1)收集大鼠大腿骨和胫骨中的骨髓细胞，悬浮于细胞培养液中；
[0013] (2)细胞悬浮液通过葡聚糖凝胶S印hadex GlO色谱柱，用细胞培养液洗涤，收集细 胞；
[0014] (3)收集得到的细胞种于培养板内，培养板内添加含有细胞因子的培养基共同培 养，每隔2天换液，培养4-7天；
[0015] 其中，步骤（3)中所述培养基为含有KT8Mla, 25(0H)2D3、20-100ng/ml破骨细胞生 成因子、10-50ng/ml巨噬细胞集落刺激因子、15-20%胎牛血清的DMEM。
[0016] 在上述破骨细胞培养体系的获得方法中，步骤（1)或（2)所述的细胞培养液优选 含有15-20%胎牛血清的DMEM。
[0017] 在上述破骨细胞培养体系的获得方法中，步骤（3)中种于培养板中的细胞数优选 为 1 X 106-4X 106 个/cm2。
[0018] 在上述破骨细胞培养体系的获得方法中，步骤（1)所述大鼠优选为4-6周龄。
[0019] 本发明的破骨细胞培养体系获得的破骨细胞，显示很强的抗酒石酸酸性磷酸酶 (TRAP+)染色活性，在象牙片的骨吸收实验中也显示强的骨吸收能力。
[0020] 本发明的破骨细胞培养体系培养方法简单，使用的相关细胞因子价格低，使用量 少，培养成分低。另一方面，本发明的培养体系稳定，得到的破骨细胞数量多，具有典型的破 骨细胞性质，有利于大量测定抑制骨吸收药物的生物活性，继而开发有效的骨吸收疾病治 疗要药物。
【具体实施方式】
[0021 ] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和 材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，或可以常规方法制备。
[0022] 实施例1破骨细胞的培养
[0023] 取4周龄的SD雄性大鼠，麻醉后托颈处死，放在75%乙醇中浸泡片刻，在无菌条件 下，取出大鼠大腿骨和胫骨，去净骨表面的软组织，用无菌PBS反复冲洗2-3次，最后置于含 有15%胎牛血清的DMEM培养液中，剪断大腿骨和胫骨的两端，并用注射器取吸取含15%胎 牛血清的DMEM培养液，反复冲洗骨髓细胞，直至骨头发白。将冲洗的骨髓细胞收集于50ml 离心管中，在l〇〇〇rpm，4°C下离心10分钟，去上清液。再加入DMEM培养液，将离心管内的 细胞均匀悬浮于培养液中，再离心，去上清液，反复洗2-3次。最后加入适量含有15%胎牛 血清的DMEM培养液吹打均匀，上葡聚糖凝胶S印hadex GlO色谱柱，用含有15%胎牛血清的 DMEM培养液，收集洗脱液中的细胞，1000rpm，4°C下离心10分钟，去上清液。细胞中加入适 量培养培养液，并加入含有la，25 (OH)2D3 (VD3)、破骨细胞生成因子（RANKL)和巨噬细胞集 落刺激因子（M-CSF)的15%胎牛血清的DMEM，其中VD 3、RANKL和M-CSF的最终浓度分别为 10_8M、50ng/ml、20ng/ml。加入细胞因子的细胞种于96孔板中，每孔中的细胞数3X IO5个 细胞，在37°C，5%C02培养箱培养。每两天换液一次，共培养4天。
[0024] 实施例2破骨细胞活性测定
[0025] 用两种方法测定。
[0026] 1.抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP+)染色活性：实施例1中，培养4天的细胞，轻轻吸 取培养上清液后加入0. 5ml/孔0. 5%TRIT0N X-100,放置20分钟，固定细胞。将清除固定 液，细胞用PBS轻轻清洗2-3次，用TRAP+染色试剂盒（sigma，N 〇387)染色，并在显微镜下 统计具有3个以上细胞核的TRAP阳性破骨细胞，结果表明96孔板的每孔上形成的破骨细 胞的平均数量为124个。
[0027] 2.对象牙片的骨吸收活性：
[0028] (1)将直径约3. 7mm，厚度约2. 7μπι的象牙片，用75%乙醇浸泡5个小时，用无血 清的DMEM反复冲洗后，在紫外灯下放置12小时以上。将消毒处理后的象牙片平铺于96孔 板中，备用。
[0029] (2)实施例1中，培养4天的细胞，轻轻吸取培养上清液后加入0.05%胰蛋白 酶-0. 02%EDTA0. 5ml，联合消化培养板中的细胞5min，加入0. 5ml/孔含15%胎牛血清的 DMEM培养液终止胰蛋白酶的消化作用。将消化下来的细胞收集于离心管中，在lOOOrpm， 4°C下离心5分钟，去上清液。然后迅速加入含15%胎牛血清的DMEM培养液，均匀悬浮细 胞，将细胞轻轻加入到步骤（1)中的铺有象牙片的96孔板中，细胞数为2 X IO5个/孔。在 37°C，5%C02培养箱中培养，每3天换液。培养5天后，弃去培养上清液，2%TRIT0N X-100固 定IOmin,于0. 25mol/L氢氧化铵中超声波清洗3次，每次5min，依次在50%乙醇，60%乙醇， 70%乙醇，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，100乙醇和无水乙醇中梯度脱水后，1%甲苯胺蓝染 液中染色1-2分钟，蒸馏水清洗3次，在显微镜下观察吸收陷窝，并计数。每孔中的平均吸 收陷窝数为153个。陷窝面积用Scion Image version Beta4.02software计算，每孔中的 平均吸收陷窝面积为298mm2。
[0030] 实施例3
[0031] 按实施例1的方法准备破骨细胞培养体系，将准备好的铺好细胞的96孔板中，力口 入不同浓度的OPG-Fc融合蛋白，其最终浓度分别为300 μ g/Ι、100 μ g/1、1 μ g/1、300ng/l、 100ng/l、30ng/l、lng/1、0· 0lng/1，每个浓度设4个平行孔。以不加入OPG-Fc融合蛋白，力口 入相当体积的培养液的为对照组。对照组也设4个平行孔。
[0032] 加入不同浓度药物和培养液的细胞，在在37°C，5%C02培养箱培养。每两天换液一 次，共培养4天。
[0033] 按照实施例2所述的方法测定抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP+)染色活性。测定结果 如表1。
【主权项】
1. 一种测定抑制骨吸收药物生物活性的方法，其特征在于，在体外诱导的破骨细胞培 养体系中，加入不同浓度的待测药物，测定破骨细胞功能。
2. 根据权利要求1所述的测定抑制骨吸收药物生物活性的方法，其特征在于，所述体 外诱导的破骨细胞培养体系是大鼠骨髓源性细胞诱导的培养体系。
3. 根据权利要求1所述的测定抑制骨吸收药物生物活性的方法，其特征在于，所述破 骨细胞功能包括抗酒石酸酸性磷酸酶染色活性和在象牙片上骨吸收活性。
4. 根据权利要求1所述的测定抑制骨吸收药物生物活性的方法，其特征在于，所述体 外诱导的破骨细胞培养体系，通过如下方法获得； (1) 收集大鼠大腿骨和胫骨中的骨髓细胞，悬浮于细胞培养液中； (2) 细胞悬浮液通过葡聚糖凝胶Sephadex GlO色谱柱，用细胞培养液洗涤，收集细胞； (3 )收集得到的细胞种于培养板内，培养板内添加含有细胞因子的培养基共同培养，每 隔2天换液，培养4-7天； 其中，步骤（3)中所述培养基为含有10_8Mla，25(0H)2D3、20-100ng/ml破骨细胞生成因 子、10-50ng/ml巨噬细胞集落刺激因子、15-20%胎牛血清的DMEM。
【专利摘要】本发明提供了一种测定抑制骨吸收药物生物活性的方法，其特征在于，在体外诱导的破骨细胞培养体系中，加入不同浓度的待测药物，测定破骨细胞功能。本发明所述破骨细胞培养体系培养方法简单，使用的相关细胞因子价格低，使用量少，培养成分低。本发明的培养体系稳定，得到的破骨细胞数量多，具有典型的破骨细胞性质，有利于大量测定抑制骨吸收药物的生物活性，继而开发有效的骨吸收疾病治疗要药物。
【IPC分类】C12Q1-02
【公开号】CN104561226
【申请号】CN201310498692
【发明人】秦宏佳
【申请人】大连市沙河口区中小微企业服务中心
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月21日