专利名称：一种用于表征外周调节性t细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，特别是涉及一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法及其应用，特别的说是一种用于表征调节性T细胞抑制活性变化和靶向组织免疫应答机制及其应用，是发现一种用于表征调节性T细胞中具有抑制活性的细胞群的状态变化而介导靶向组织免疫应答之间的机制，及其在用于动态监测调节性T细胞抑制活性试剂盒中的应用、及在用于制备筛选胰腺早期病变靶标的试剂盒中的应用。
背景技术：
研究发现自体免疫性糖尿病是一种自发免疫性疾病并呈现渐进性发展过程，由于免疫调节活性下降，降低其对内源性效应T细胞的抑制效应，由效应T细胞而介导的特异性攻击胰岛β细胞一即体内唯一合成分泌胰岛素的单位，因此，胰岛破坏的结果直接造成胰岛素分泌数量减少，而胰岛素的功能将血中的葡萄糖运至相应的细胞内，供细胞正常生理活动需要。胰岛素数量减少又直接影响到血中的葡萄糖代谢利用。当80 90%的胰岛被破坏使得胰岛素分泌数量降至临界值时，尚存的内源性胰岛素无法维持生理所需的糖代谢，血中的葡萄糖异常升高，此时发展成为临床期的I型糖尿病。疾病发展至此，病人表现出相应的临床症状和体征，实验室检查发现血液和尿液中的葡萄糖值升高，以及其它的一些辅助检查都可以帮助诊断，但主要是依据血糖的升高程度诊断糖尿病。目前对I型糖尿病的发病机制和诊治中存在局限；首先，虽然学术界对外周免疫耐受失衡是造成自体免疫病发生的成因已经有共识，即耐受平衡调节的关键取决于免疫调节细胞群的表达，但一些科学·实验中发现免疫调节细胞群高低与它应具备的调节功能间存在矛盾，研究发现免疫调节细胞的数量高低与它应该发挥的作用无关(Anne Cooke英国剑桥大学发表在国际免疫学杂志)，免疫调节细胞群中存在“僵尸细胞”，因此如何界定具有确切调节功能活性的靶位成为关键；其次，由于血糖持续的异常升高受到很多因素的影响，波动较大且容易有误差，而且只有在胰岛被破坏减少到临界值后，内在的病变发展至临床期后才表现出来。因此，不能全面和系统体现疾病的发生和进展，尤其无法反映免疫攻击胰岛细胞的早期病变，另外，胰腺组织活检虽然可以反映病变局部的病理变化，它却受到活检带来的手术创伤等并发症以及无法被医生和患者接受的制约。
发明内容
本发明突破目前自体免疫病发病机制研究中的困局，解决了单纯依赖外周免疫调节细胞表达量的高低无法客观体现它实际发挥的调节功能间的矛盾，找到特异性靶位可以科学地反映调节性T细胞免疫抑制活性，并进一步公开了相应的细胞群检测方法，从而实现动态监测调节性T细胞抑制活性状态，以及作为筛选自体免疫糖尿病的靶器官胰腺早期病变的靶标，奠定了重要的基础。具体地，本发明公开了一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的靶向细胞群的检测方法，包括以下步骤:
步骤I)将待测样本处理，形成单细胞悬液；具体来说，将待测外周血或动物脾脏按照常规方法处理，去红细胞过滤后制备得到淋巴细胞悬液；
步骤2)特征细胞群的抗体染色:
将上述单细胞悬液分别与标记不同荧光的单抗体⑶3、⑶4、⑶69混匀，冰上孵育30分
钟；
步骤3)混合液PBS洗液调匀，加入细胞破膜裂解液，混匀冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液，充分混匀后离心，去上清；
步骤4)新鲜配制脱氧核糖核酸酶液，加入到步骤4)中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液，充分混匀后离心，去上清，
步骤5)加入抗体Fe阻断剂，充分作用20分钟；
步骤6)分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子(FoxP3)和脱氧核糖核酸(BrdU)复制的抗体；所述的BrdU、FoxP3分别采用不同荧光标记，分取1.5 μ I抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清；
步骤7)流式细胞仪检测:` 加入流式细胞洗液充分混匀后离心，去上清，加入500ul流式细胞洗液，流式细胞仪检测得到染色的活性调节性T细胞的占比。进一步地，本发明还公开了所述步骤2)中，单细胞悬液与标记了不同荧光的单抗体的混合比例分别为:单细胞悬液与⑶3以体积计算为1:400、单细胞悬液与⑶4以体积计算为1:200、单细胞悬液与⑶69以体积计算为1:150 ;单细胞悬液与BrdU以体积质量比计算为1.5ul:1 ug、单细胞悬液与FoxP3以体积质量比计算为1.5ul:lug。作为进一步的优化，本发明还公开了步骤I)中所述单细胞悬液的终浓度为I X 107/ml,混匀后取IOOul的细胞悬液为实验对象。同时，本发明还公开了所述步骤2)中，细胞悬液与⑶3、⑶4、⑶69在4°C的条件下结合孵育30分钟，再用PBS洗涤2次。不仅如此，本发明还公开了所述步骤4)中，所得沉淀用细胞破膜辅液重复洗涤一次，充分混匀后离心，去上清。本发明在总体调节性T细胞中通过发现靶位找到具有实际调节功能的细胞群，并通过本发明公开的抗体染色方法，将这一特征细胞群同时表征并定量统计出来，达到科学量化具有抑制活性的调节性T细胞的目的，解决了目前业内普遍存在的因单纯关注调节性T细胞总数量，而造成对免疫调控机能状态错判的问题；也科学解释了调节机制在自体免疫病特别是I型糖尿病发生、发展的病理进程中的作用。同时，本发明所公开的特征细胞群检测方法，推广到I型糖尿病患病及潜在发病人群，以外周静脉血作为检测样本，从而为检测调节性T细胞抑制活性、以及无创伤地筛选胰腺早期病变靶标奠定了基础。
同时，本发明进一步公开了所述的用于表征调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法在用于调节性T细胞抑制活性试剂盒中的应用。特别是在用于靶向检测调节性T细胞抑制活性试剂盒中的应用。以及所述的用于表征调节性T细胞抑制活性的方法在用于制备筛选胰腺早期病变靶标的试剂盒中的应用。特别是靶向检测外周调节性T细胞抑制活性的方法在用于制备筛选胰腺早期病变靶标的试剂盒中的应用。从而克服了常规的血糖监测无法客观并全面反映出自身免疫攻击胰岛细胞不同阶段病变的局限，以及胰腺组织活检带来的手术创伤等并发症的难题。本文中FoxP3是指转录因子；BrdU是指5_溴脱氧尿嘧啶核苷。
图1-1为处于模型第四周雌鼠的淋巴细胞流式细胞仪检测结果；
图1-2为处于模型第十周雌鼠的淋巴细胞流式细胞仪检测结果；
图1-3为处于模型第十六周雌鼠的淋巴细胞流失细胞仪检测结果；
图2为实施例10中处于疾病进程不同阶段的雌鼠对应的特征细胞群在调节性T细胞总量中占比的曲线示意 图3-1为实施例11中A组小鼠的淋巴细胞流式细胞仪检测结果； 图3-2为实施例11中B组小鼠的淋巴细胞流失细胞仪检测结果；
图4-1为处于模型第四周的雌鼠的胰脏染色标本；
图4-2为A组小鼠的胰腺染色标本；
图4-3为处于模型第十周的雌鼠的胰脏染色标本；
图4-4为B组小鼠的胰腺染色标本；
图4-5为处于模型第十六周的雌鼠的胰腺染色标本；
图5为处于胰腺病变不同阶段的雌鼠对应的特征细胞群在调节性T细胞总量中占比的曲线示意 图6为实施例13中胰腺病变不同阶段的雌鼠的血糖示意 图7为实施例14中治疗组与对照组雌鼠的特征细胞群在调节性T细胞总量中占比的最终状态不意 图8为实施例14中治疗组与对照组雌鼠的血糖示意图。
具体实施例方式下面结合实施例和附图进一步说明本发明，在以下实施例中，除非特别说明，否则用到的试剂、仪器、设备均为常规的符合相应功能性要求的市售产品。实施例1
采集受检者外周静脉血，将待测外周静脉血处理并从中分离T细胞，具体的分离方式可以参照现有技术。采用 尼龙膜网过滤分离法得到单核细胞后，制备形成单细胞悬液，为了便于后续的染色等操作，通常我们将单细胞悬液浓度制备成I X lOVml,混匀后取IOOul为实验对象。然后我们对单细胞悬液中的特征细胞群进行抗体染色，具体的操作步骤如下: 将上述单细胞悬液分别与荧光抗体⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
混合标记的操作方法按照相关抗体的使用说明操作。经过标记的混合液以流式细胞洗液调匀，加入细胞破膜裂解液，混匀后，在冰上或者与冰上相同的温度条件下孵育30分钟，再用细胞破膜辅液进行洗涤，充分混匀后离心，去上清;
将新鲜配制脱氧核糖核酸酶液，加入到前述步骤中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液，充分混匀后离心，去上清，
得到的沉淀中加入抗体Fe阻断剂，充分作用20分钟；
分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子(FoxP3))和脱氧核糖核酸复制(BrdU)的抗体，所述的BrdU、FoxP3分别不同的荧光标记，分取1.5 μ I抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清；
将沉淀通过流式细胞仪检测:
加入流式细胞洗液充分混匀后离心，去上清，加入500ul流式细胞洗液，流式细胞仪检测得到染色的活性调节性T细胞的占比。针对我们的发明目的，上述染色方法有效地选择这些代表淋巴细胞特有属性的分子标志，并且考虑去除非特异染色的干扰，既利用各分子的独有标志，又可将其和其它分子标志联合来界定新的功能标的。
实施例2
采集受检者外周静脉血，将待测外周静脉血处理并从中分离T细胞，具体的分离方式可以参照现有技术。采用尼龙膜网过滤分离法得到单核细胞后，制备形成单细胞悬液，为了便于后续的染色等操作，通常我们将单细胞悬液浓度制备成I X lOVml,混匀后取IOOul为实验对象。然后我们对单细胞悬液中的特征细胞群进行抗体染色，具体的操作步骤如下: 将上述单细胞悬液分别与荧光抗体⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
在本实施例中优选单细胞悬液与荧光抗体的稀释比例分别为:单细胞悬液与CD3以体积计算为1:400、单细胞悬液与⑶4以体积计算为1:200、单细胞悬液与⑶69以体积计算为1:150，不同比例稀释后达到体积重量比为Iul:1 ug ；而单细胞悬液与BrdU以体积质量比计算为1.5ul:1 ug、单细胞悬液与FoxP3以体积质量比计算为1.5ul:lug。经过标记的混合液以流式细胞洗液调匀，加入细胞破膜裂解液，混匀后，在冰上或者与冰上相同的温度条件下孵育30分钟，再用细胞破膜辅液进行洗涤，充分混匀后离心，去上清;
将新鲜配制脱氧核糖核酸酶液，加入到前述步骤中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液，充分混匀后离心，去上清；
得到的沉淀中加入抗体Fe阻断剂，充分作用20分钟；
将经过抗体Fe阻断剂作用后的溶液中分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子和脱氧核糖核酸复制的抗体(分别不同荧光标记BrdU、FoxP3)，分取1.5 μ I抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清；加入流式细胞洗液充分混匀后离心，去上清，加入500ul流式细胞洗液，流式细胞仪检测得到染色的活性调节性T细胞的占比。体现了在实验实施中，优化抗体浓度和剂量，保障统计结果的稳定和抗体高效作用。实施例3
采集受检者外周静脉血，将待测外周静脉血处理并从中分离T细胞，具体的分离方式可以参照现有技术。采用尼龙膜网过滤分离法得到单核细胞后，制备形成单细胞悬液，为了便于后续的染色等操作，通常我们将单细胞悬液浓度制备成I X lOVml,混匀后取IOOul为实验对象。然后我们对单细胞悬液中的特征细胞群进行抗体染色，具体的操作步骤如下: 将上述单细胞悬液分别与荧光抗体⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；细胞悬液与
⑶3、⑶4、⑶69在4°C的条件下结合孵育30分钟，再用PBS洗涤2次。经过标记的混合液以流式细胞洗液调匀，加入细胞破膜裂解液，混匀后，在冰上或者与冰上相同的温度条件下孵育30分钟，再用细胞破膜辅液进行洗涤，洗涤后离心，取沉淀；
将新鲜配制脱氧核糖核酸酶液，加入到前述步骤中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液，洗涤， 离心，取沉淀，
得到的沉淀中加入抗体Fe阻断剂，充分作用20分钟；
将经过抗体Fe阻断剂作用后的溶液中分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子(FoxP3))和脱氧核糖核酸复制(BrdU)的抗体，所述的BrdU、FoxP3分别不同的荧光标记，分取1.5 μ I抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清；
加入流式细胞洗液充分混匀后离心，去上清，加入500ul流式细胞洗液，流式细胞仪检测得到染色的活性调节性T细胞的占比。我们优化实验需要的温度、孵化时间等条件，从而在同一个细胞样品中检测两种不同的膜内细胞器的功能状态，改进了传统的染色方法。
实施例4
采集受检者外周静脉血，将待测外周静脉血处理并从中分离T细胞，具体的分离方式可以参照现有技术。采用尼龙膜网过滤分离法得到单核细胞后，制备形成单细胞悬液，为了便于后续的染色等操作，通常我们将单细胞悬液浓度制备成I X lOVml,混匀后取IOOul为实验对象。然后我们对单细胞悬液中的特征细胞群进行抗体染色，具体的操作步骤如下: 将上述单细胞悬液分别与荧光抗体⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
经过标记的混合液以流式细胞洗液调匀，加入细胞破膜裂解液，混匀后，在冰上或者与冰上相同的温度条件下孵育30分钟，再用细胞破膜辅液进行洗涤，洗涤后离心，取沉淀；
将新鲜配制脱氧核糖核酸酶液，加入到前述步骤中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液，洗涤，离心，取沉淀，所得沉淀用细胞破膜辅液重复洗涤一次，离心，取沉淀；得到的沉淀中加入抗体Fe阻断剂，充分作用20分钟；
将经过抗体Fe阻断剂作用后的溶液中分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子(FoxP3))和脱氧核糖核酸复制(BrdU)的抗体，所述的BrdU、FoxP3分别不同的荧光标记，分取1.5 μ I抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清；
加入流式细胞洗液充分混匀后离心，去上清，加入500ul流式细胞洗液，流式细胞仪检测得到染色的活性调节性T细胞的占比。从而优化了两种膜内细胞器的抗体滴度和剂量。实施例5
采集受检者外周静脉血，将待测外周静脉血处理并从中分离T细胞，具体的分离方式可以参照现有技术。采用尼龙膜网过滤分离法得到单核细胞后，制备形成单细胞悬液，为了便于后续的染色等操作，通常我们将单细胞悬液浓度制备成I X lOVml,混匀后取IOOul为实验对象。然后我们对单细胞悬液中的特征细胞群进行抗体染色，具体的操作步骤如下: 将上述单细胞悬液分别 与荧光抗体⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
在本实施例中优选单细胞悬液与荧光抗体的稀释比例分别为:单细胞悬液与CD3以体积计算为1:400、单细胞悬液与⑶4以体积计算为1:200、单细胞悬液与⑶69以体积计算为1:150，不同比例稀释后达到体积重量比为Iul:1 ug ；而单细胞悬液与BrdU以体积质量比计算为1.5ul:1 ug、单细胞悬液与FoxP3以体积质量比计算为1.5ul:lug。细胞悬液与⑶3、⑶4、⑶69在4°C的条件下结合孵育30分钟，再用PBS洗涤2次。经过标记的混合液以流式细胞洗液调匀，加入细胞破膜裂解液，混匀后，在冰上或者与冰上相同的温度条件下孵育30分钟，再用细胞破膜辅液进行洗涤，洗涤后离心，取沉淀；
将新鲜配制脱氧核糖核酸酶液，加入到前述步骤中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液，洗涤，离心，取沉淀，
得到的沉淀中加入抗体Fe阻断剂，充分作用20分钟；
将经过抗体Fe阻断剂作用后的溶液中分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子(FoxP3))和脱氧核糖核酸复制(BrdU)的抗体，所述的BrdU、FoxP3分别不同的荧光标记，分取1.5 μ I抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清；
加入流式细胞洗液充分混匀后离心，去上清，加入500ul流式细胞洗液，流式细胞仪检测得到染色的活性调节性T细胞的占比。实施例6
采集受检者外周静脉血，将待测外周静脉血处理并从中分离T细胞，具体的分离方式可以参照现有技术。采用尼龙膜网过滤分离法得到单核细胞后，制备形成单细胞悬液，为了便于后续的染色等操作，通常我们将单细胞悬液浓度制备成I X lOVml,混匀后取IOOul为实验对象。然后我们对单细胞悬液中的特征细胞群进行抗体染色，具体的操作步骤如下: 将上述单细胞悬液分别与荧光抗体⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；经过标记的混合液以流式细胞洗液100 μ I调匀，加入细胞破膜裂解液100 μ 1，混匀后，在冰上或者与冰上相同的温度条件下孵育30分钟，再用细胞破膜辅液进行洗涤，洗涤后离心，取沉淀；
将新鲜配制脱氧核糖核酸酶液100μ 1，加入到前述步骤中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液，洗涤，离心，取沉淀，
得到的沉淀中加入抗体Fe阻断剂，充分作用20分钟；
将经过抗体Fe阻断剂作用后的溶液中分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子和脱氧核糖核酸复制的抗体(分别不同荧光标记BrdU、FoxP3)，分取1.5 μ I抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清；
加入流式细胞洗液充分混匀后离心，去上清，加入500ul流式细胞洗液，流式细胞仪检测得到染色的活性调节性T细胞的占比。实施例7
采集受检者外周静脉血，将待测外周静脉血处理并从中分离T细胞，具体的分离方式可以参照现有技术。采用尼龙膜网过滤分离法得到单核细胞后，制备形成单细胞悬液，为了便于后续的染色等操作，通常我们将单细胞悬液浓度制备成IX lOVrnl，混匀后取IOOul为实验对象。
然后我们对单细胞悬液中的特征细胞群进行抗体染色，具体的操作步骤如下: 将上述单细胞悬液分别与荧光抗体⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
经过标记的混合液以流式细胞洗液100 μ I调匀，加入细胞破膜裂解液100 μ 1，混匀后，在冰上或者与冰上相同的温度条件下孵育30分钟，再用细胞破膜辅液进行洗涤，洗涤后离心，取沉淀；
将新鲜配制脱氧核糖核酸酶液100μ 1，加入到前述步骤中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤，离心，取沉淀，
得到的沉淀中加入抗体Fe阻断剂10 μ 1，充分作用20分钟；
将经过抗体Fe阻断剂作用后的溶液中分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子(FoxP3))和脱氧核糖核酸复制(BrdU)的抗体，所述的BrdU、FoxP3分别不同的荧光标记，分取1.5 μ I抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清；
将沉淀通过流式细胞仪检测:
加入流式细胞洗液充分混匀后离心，去上清，加入500ul流式细胞洗液，流式细胞仪检测得到染色的活性调节性T细胞的占比。实施例8
采集受检者外周静脉血，将待测外周静脉血处理并从中分离T细胞，具体的分离方式可以参照现有技术。采用尼龙膜网过滤分离法得到单核细胞后，制备形成单细胞悬液，为了便于后续的染色等操作，通常我们将单细胞悬液浓度制备成I X lOVml,混匀后取IOOul为实验对象。然后我们对单细胞悬液中的特征细胞群进行抗体染色，具体的操作步骤如下: 将上述单细胞悬液分别与荧光抗体⑶3、⑶4、⑶69以及BrdU、FoxP3混合；
在本实施例中优选单细胞悬液与荧光抗体的稀释比例分别为:单细胞悬液与CD3以体积计算为1:400、单细胞悬液与⑶4以体积计算为1:200、单细胞悬液与⑶69以体积计算为1:150，不同比例稀释后达到体积重量比为Iul:1 ug ；而单细胞悬液与BrdU以体积质量比计算为1.5ul:1 ug、单细胞悬液与FoxP3以体积质量比计算为1.5ul:lug。细胞悬液与⑶3、⑶4、⑶69在4°C的条件下结合孵育30分钟，再用PBS洗涤2次。经过标记的混合液以流式细胞洗液100 μ I调匀，加入细胞破膜裂解液100 μ 1，混匀后，在冰上或者与冰上相同的温度条件下孵育30分钟，再用细胞破膜辅液进行洗涤，洗涤后离心，取沉淀；
将新鲜配制脱氧核糖核酸酶液100μ 1，加入到前述步骤中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤，离心，取沉淀，
得到的沉淀中加入抗体Fe阻断剂10 μ 1，充分作用20分钟； 将经过抗体Fe阻断剂作用后的溶液中分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子(FoxP3))和脱氧核糖核酸复制(BrdU)的抗体，所述的BrdU、FoxP3分别不同的荧光标记，分取1.5 μ I抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清；
将沉淀通过流式细胞仪检测:
加入流式细胞洗液充分混匀后离心，去上清，加入500ul流式细胞洗液，流式细胞仪检测得到染色的活性调节性T细胞的占比。实施例10 调节性T细胞抑制活性检验
本实施例的设计思路，是通过造模技术，人工构造由于远端器官免疫应答直接攻击胰岛细胞发生I型糖尿病模型，利用这一模型构造可预测的调节性T细胞抑制活性的相应变化模型，并根据本发明所公开的技术手段跟踪监测模型不同阶段的小鼠特征细胞群的动态变化状态，期待形成一个具有规律性的关系。为了更为准确的获得相关的关系，我们以每半周为一个时间点，按照如下的方式获得了相关曲线。在本实施例中为了便于说明，我们仅选取了其中具有代表性的三个时间点进行相关说明，但是其他的时间点均在此曲线允许的平均值、标准值偏移范围内。操作方式:
第一步，I型糖尿病的动物模型建立NOD小鼠分取三组作为实验对象:
A.1组4周龄雌性鼠随机抽取8只；
2组10周龄雌性鼠且连续2天尾静脉血糖低于200mg/dl随机抽取8只；
3组16周龄雌性鼠且连续2天尾静脉血糖高于350mg/dl随机抽取8只作为实验对象。B.各组实验NOD小鼠分别服用含有DNA precursor 一 5-bromo-2_deoxyuridine (市售)的无菌水，浓度为lmg/ml充分溶解,连续5天饮养,期间观察一般状态包括:活动、饮食、饮水、粪便无明显异常，并监测记录尾静脉血糖值。注意将5-bromo-2-deoxyuridine每天新鲜配制并避光操作。C.将各实验组动物的脾脏、胰腺周围淋巴结制备单细胞悬液，终浓度为1X107 / ml。D.将制备好脾脏及淋巴细胞单细胞悬液用于抗体染色，单细胞悬液与荧光抗体的稀释比例分别为:单细胞悬液与⑶3以体积稀释为1:400、单细胞悬液与⑶4以体积稀释为1:200、单细胞悬液与⑶69以稀释计算为1:150，不同比例稀释后达到抗体体积重量比为Iul:1 ug;单细胞悬液与BrdU抗体以体积重量比计算为1.5ul:1 ug、单细胞悬液与抗体FoxP3以体积重量比计算为1.5ul:lug。细胞悬液与⑶3、⑶4、⑶69在4°C的条件下结合孵育30分钟，再用PBS洗涤2次。E.细胞悬液以流式细胞洗液IOOul调匀，加入细胞破膜裂解液lOOul，混匀冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200ul洗涤细胞悬液，离心后倒掉上清。F.新鲜配制DNase液，IOOul加入细胞，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液200ul洗涤细胞悬液，离心后倒掉上清，重复洗涤一次。G.加入抗体Fe阻断剂，IOul充分作用20分钟。H.加入细胞核转录因子和分化活化检测抗体，分取1.5ul荧光标记抗体冰上孵育，再用细胞破膜辅液200ul洗涤细胞悬液，离心后倒掉上清，最后流式细胞洗液200ul再次洗涤细胞，离心后倒掉上清，最终加入500ul流式细胞洗液，上流式细胞仪检测。检测结果如图1-1至图1-3所示，随着模型中小鼠的患病时间延长，其调节性T细胞的抑制活性应该逐渐降低，我们分别统计图1-1至图1-3中的染色后的特征细胞群中的细胞数量，并通过统计学分析，计算特征细胞群组在调节性T细胞总量中的占比，得到如图2所示的曲线图，发现随着时间的推移，特征细胞群细胞在调节性T细胞总量中的占比逐渐下降，与调节性T细胞的抑制活 性是相对应，并呈现正相关。我们将图2中所示的曲线及其相关数据作为调节性T细胞的抑制活性标准参考数据；并且以特征细胞群组的占比作为活性指标衡量参数。位于曲线上端的点相应的调节性T细胞抑制活性高，向曲线下端移动，越靠近下端的点其对应的调节性T细胞抑制活性越低。实施例11 调节性T细胞抑制活性曲线图的应用与验证
第一步骤:按照实施例10中的I型糖尿病的动物模型建立方式造模。第二步骤:随机选取不同阶段的小鼠进行实验。第三步骤:
3-1.分别采集小鼠A组、B组的外周静脉血，并按照实施例8中的方式进行处理、分析，获得对应的染色的调节性T细胞数量，如图3-1和图3-2所示。通过统计学分析，计算特征细胞群组在调节性T细胞总量中的占比，其中小鼠A组的占比数据为29，小鼠B组的占比数据为16。3-2.将3-1中采集完外周静脉血的小鼠A组、B组进行胰腺摘取、染色，用于检验相应胰腺状态下所呈现的调节性T细胞抑制活性是否与3-1中通过标准曲线获得的的数据对应。具体的操作可以参考如下步骤，
1.在无菌条件下，常规麻醉和手术操作，分离胰腺组织。2.胰腺组织以福尔马林固定，胰腺组织石蜡包块，常规制备成4um的切片。3.切片经过脱蜡、水化、染色及封片完成。每个小鼠的胰腺组织至少连续备片10张作为标本。每隔3张单染一片苏木精一伊红染色，显微镜检查。4.苏木精一伊红染色之间的白片分别以DAPI和德克萨斯红标记的胰岛素抗体进行单片同染，胰岛素抗体为1:50倍稀释，2小时孵育后PBS洗片，加孵DAPI染色，PBS清洗，以荧光显微镜检查。5.苏木精一伊红染色可以形态上显现健康状态下的胰岛结构或是淋巴细胞侵润破坏胰岛时的状态。6.而DAPI和德克萨斯红染色可以同比显示胰岛形态和结构，周边是否有淋巴细胞侵润，侵润后的胰岛结构首否破坏，并且胰岛分泌胰岛素的数量是否正常 或减少，通过病理检查可以诊断免 疫攻击胰岛β细胞状态以及病变程度和所处阶 段。胰脏的切片标本染色结果参见图4-2 (小鼠A组)和图4-4 (小鼠B组)，为了便于观察我们将实施例10中，第四周、第十周、第十六周的胰脏按照本实施例3-2中的标本制作方式进行处理，分别如图4-1、4-3、4-5所示。可以看出小鼠A的胰脏病理表现出一道周围淋巴细胞浸润、形态改变以及胰岛素分泌减少，且其严重程度位于图4-1与图4-3显示的病理表现之间；也就是说位于第四周与第十周之间，与占比数据16所对应的小鼠所处的病理时间相对应。同时我们可以看出小鼠B的胰脏病理表现出更为严重淋巴细胞侵入胰腺，造成胰岛素染色明显减少的状态。观察其染色结果，其病理表现位于图4-3与4-5显示的病理表现之间，也就是说此小鼠B位于第十周到第十六周的模型阶段，与占比数据29所对应的小鼠所处的病理时间相对应。实施例12筛选胰腺早期病变靶标
本实施例的设计思路，是通过造模技术，人工构造由于远端器官免疫应答直接攻击胰岛细胞发生I型糖尿病模型，并根据本发明所公开的技术手段跟踪监测模型不同阶段的小鼠特征细胞群的动态变化状态，并期待形成一个具有规律性的关系。为了更为准确的获得相关的关系，我们以每半周为一个时间点，按照如下的方式获得了相关曲线。在本实施例中为了便于说明，我们仅选取了其中具有代表性的三个时间点进行相关说明，但是其他的时间点均在此曲线允许的平均值、标准值偏移范围内。第一步骤:按照实施例10中的I型糖尿病的动物模型建立方式造模。第二步骤:分取三组作为实验对象，
I组4周龄雌性鼠随机抽取8只；
2组10周龄雌性鼠且连续2天尾静脉血糖低于200mg/dl随机抽取8只；
3组16周龄雌性鼠且连续2天尾静脉血糖高于350mg/dl随机抽取8只作为实验对象。第三步骤:3-1.分别采集小鼠I组、2组、3组的外周静脉血，并按照实施例8中的方式进行处理、分析，获得对应的染色的调节性T细胞数量，如图1-1、图1-2和图1-3所示。通过统计学分析，计算特征细胞群组在调节性T细胞总量中的占比，其中小鼠I组的占比数据为32，小鼠2组的占比数据为18.5，小鼠3组的占比数据为13。3-2.将3-1中采集完外周静脉血的小鼠I组、2组、3组进行胰腺摘取、染色，具体的操作可以参考如下步骤，
1.在无菌条件下，常规麻醉和手术操作，分离胰腺组织。2.胰腺组织以福尔马林固定，胰腺组织石蜡包块，常规制备成4um的切片。3.切片经过脱蜡、水化、染色及封片完成。每个小鼠的胰腺组织至少连续备片10张作为标本。每隔3张单染一片苏木精一伊红染色，显微镜检查。4.苏木精一伊红染色之间的白片分别以DAPI和德克萨斯红标记的胰岛素抗体进行单片同染，胰岛素抗体为1:50倍稀释，2小时孵育后PBS洗片，加孵DAPI染色，PBS清洗，以荧光显微镜检查。5.苏木精一伊红染色可以形态上显现健康状态下的胰岛结构或是淋巴细胞侵润破坏胰岛时的状态。6.而DAPI和德克萨斯红染色可以同比显示胰岛形态和结构，周边是否有淋巴细胞侵润，侵润后的胰岛结构首否破坏，并且胰岛分泌胰岛素的数量是否正常
或减少，通过病理检查可以诊断免疫攻击胰岛β细胞状态以及病变程度和所处阶 段。检测结果如 图1-1至图1-3所示，随着模型中小鼠的患病时间延长，其调节性T细胞的抑制活性应该逐渐降低，我们分别统计图1-1至图1-3中的染色后的特征细胞群中的细胞数量，并通过统计学分析，计算特征细胞群组在调节性T细胞总量中的占比，得到如图2所示的曲线图，发现随着时间的推移，特征细胞群细胞在调节性T细胞总量中的占比逐渐下降。我们将图4-1、图4-3以及图4-5中反应出的胰腺状态作为横坐标的参考基础，并以其所在的模型阶段作为横坐标，得到图5中所示的曲线，并以这一曲线作为胰腺病变状态的参考标准。位于曲线上端的点相应的胰腺处于病变初期，向曲线下端移动，越靠近下端的点其对应的胰腺处于病变越晚期。实施例13 不同方式筛选胰腺早期病变靶标的对比试验
第一步骤1:按照实施例 ο中的I型糖尿病的动物模型建立方式造模。第二步骤:分取三组作为实验对象，
I组4周龄雌性鼠随机抽取8只；
2组10周龄雌性鼠且连续2天尾静脉血糖低于200mg/dl随机抽取8只；
3组16周龄雌性鼠且连续2天尾静脉血糖高于350mg/dl随机抽取8只作为实验对象。第三步骤:分别采集小鼠I组、2组、3组的外周静脉血，然后分别进行以下实验， 3-1.按照实施例8中的方式进行处理、分析，获得对应的染色的调节性T细胞数量，如
图1-1、图1-2和图1-3所示。通过统计学分析，计算特征细胞群组在调节性T细胞总量中的占比，其曲线图如图5所示。
3-2.按照血糖的检测方法，分别检测I组、2组、3组对应的血糖含量，其曲线图对应如图6所示。图中横线所在纵坐标值为正常的临界值，位于临界值以下的为血糖正常，位于临界值以上的为血糖异常。3-3.将采集完外周静脉血的小鼠I组、2组、3组进行胰腺摘取、染色，具体的操作可以参考如下步骤，
1.在无菌条件下，常规麻醉和手术操作，分离胰腺组织。2.胰腺组织以福尔马林固定，胰腺组织石蜡包块，常规制备成4um的切片。3.切片经过脱蜡、水化、染色及封片完成。每个小鼠的胰腺组织至少连续备片10张作为标本。每隔3张单染一片苏木精一伊红染色，显微镜检查。4.苏木精一伊红染色之间的白片分别以DAPI和德克萨斯红标记的胰岛素抗体进行单片同染，胰岛素抗体为1:50倍稀释，2小时孵育后PBS洗片，加孵DAPI染色，PBS清洗，以荧光显微镜检查。5.苏木精一伊红染色可以形态上显现健康状态下的胰岛结构或是淋巴细胞侵润破坏胰岛时的状态。6.而DAPI和德克萨斯红染色可以同比显示胰岛形态和结构，周边是否有淋巴细胞侵润，侵润后的胰岛结构首否破坏，并且胰岛分泌胰岛素的数量是否正常
或减少，通过病理检查可以诊断免疫攻击胰岛β细胞状态以及病变程度和所处阶 段。染色的标本结果见图4-1、图4-3以及图4-5。由以上实验结果可以看出，当模型处于10周时，小鼠的胰腺已经发生病变，但是血糖测试中，仍然处于正常状态范围内，因此通过血糖作为I型糖尿病发生、发展的监测手段具有缺陷性，不能及时筛选出早期病变的靶标，延误治疗时机。而通过本发明所公开的染色方法获得的调节性T细胞中特征细胞群的占比数据，可以及时反映胰腺的病理变化进程，特别是在12周之前，也就是临界血糖值以下的盲点范围内。如果直接通过胰腺组织活体检验虽然可以准确获得胰腺病变的判断，但是这种方式需要活体采样，对患者造成手术创伤和手术风险。基于准确性的原则，我们将利用本发明公开的特征细胞群检测为基础的方法与传统的活检方式进行了应用价值的比对，结果如表2 。表权利要求
1.一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法，其特征是该方法包括以下步骤: 步骤I)将待测样本处理，形成单细胞悬液； 步骤2)特征细胞群的抗体染色: 将上述单细胞悬液分别与荧光抗体⑶3、⑶4、⑶69混合； 步骤3)混合液以流式细胞洗液调匀，加入细胞破膜裂解液，混匀冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液，充分混匀后离心，去上清； 步骤4)新鲜配制脱氧核糖核酸酶液，加入到步骤4)中所得沉淀中，混匀后孵育60分钟，再用细胞破膜辅液，充分混匀后离心，去上清， 步骤5)加入抗体Fe阻断剂，充分作用20分钟； 步骤6)分别加入检测标记调节细胞表位的转录因子(FoxP3)和脱氧核糖核酸复制(BrdU)的抗体；所述的BrdU、FoxP3分别采用不同荧光标记，分取1.5 μ I抗体冰上孵育30分钟，再用细胞破膜辅液200 μ 1，洗涤细胞悬液，充分混匀后离心，去上清； 步骤7)流式细胞仪检测: 加入流式细胞洗液500ml，充分混匀后离心，去上清，加入流式细胞洗液，流式细胞仪上机检测。
2.根据权利要求1所述的一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的染色检测方法，其特征是:所述步骤2)中，单细胞悬液与荧光抗体的稀释比例分别为:单细胞悬液与⑶3以体积计算为1:400、单细胞悬液与⑶4以体积计算为1:200、单细胞悬液与⑶69以体积计算为1:150，不同比例稀释后达到体积重量比为Iul:1 Ug ；而单细胞悬液与BrdU以体积质量比计算为1.5ul:1 ug、单细胞悬液与FoxP3以体积质量比计算为1.5ul:lug。
3.根据权利要求1所述的一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法，其特征是:步骤I)中所述单细胞悬液的终浓度为lX107/ml。
4.根据权利要求1所述的一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法，其特征是:所述步骤2)中，细胞悬液与⑶3、⑶4、⑶69在4°C的条件下结合孵育30分钟，再用PBS洗涤2次。
5.根据权利要求1所述的用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法，其特征是:所述步骤4)中，所得沉淀用细胞破膜辅液重复洗涤一次，混匀后离心，去上清。
6.权利要求1至5中任意一项所述的检测方法在用于制备调节性T细胞抑制活性检验试剂盒中的应用。
7.权 利要求1至5中任意一项所述的检测方法在用于制备筛选胰腺早期病变靶标的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药领域，特别是涉及一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法及其应用，更为具体的说是涉及一种用于表征外周调节性T细胞抑制活性的特征细胞群的检测方法及其在用于制备调节性T细胞抑制活性检验试剂盒中的应用、以及在用于制备筛选胰腺早期病变靶标的试剂盒中的应用。否定了外周免疫调节细胞群与它应具备的调节功能间存在矛盾，免疫调节细胞的数量高低与它应该发挥的作用无关的业内普遍理论，找到了一组对调节性T细胞抑制活性具有表征价值的细胞群，并进一步公开了相应的细胞群检测方法，从而对调节性T细胞抑制活性，以及筛选胰腺早期病变靶标奠定了重要的基础。
文档编号G01N33/66GK103235135SQ20131015013
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年4月26日
发明者史其新 申请人:史其新