一种植物维管束发育基因sm-Nvas及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明提供了一种受水杨酸和稻瘟病菌的双诱导的植物维管束发育基因 sm-Nvas，该基因用于水稻抗稻瘟病和白叶枯病分子育种，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 植物维管束系统包含木质部和韧皮部，都由原形成层细胞发育而来。原形成层细 胞具有强大的功能，形成的木质部和韧皮部存在于各种特化的组织器官中，比如叶、茎和根 等。维管束在植物体内形成束状，连接植物的各个部位，为植物提供水、养分及植物生长所 必要的其它物质。在植物的分生组织细胞中，韧皮部、原形成层、木质部细胞系在早期就特 定发育和分化，这一系列事件的发生通常需要特异基因直接或间接的作用。
[0003] VASCULAR-RELATEDNAC-DOMAIN(VND)的两个转录因子VND6 和VND7 分别促进后 生木质部和初生木质部的分化。产生于韧皮部的II)IF(CLE41/CLE44)在抑制木质部分化的 同时还增加原形成层细胞的增殖。PXY/TDR对于维持形成层细胞的分裂和木质部、韧皮部 的空间排布是必需的。TDIF作为信号分子与其受体PXY/TDR介导韧皮部和木质部之间的 信号传递，两者相互作用能够维持形成层干细胞的活力，并调控其向木质部的分化。W0X4 在原形成层和形成层中优先表达，在TDR/TDIF的作用下表达量上调。遗传分析显示W0X4 基因在促进原形成层和形成层的增殖是必需的，但对于原形成层分化为木质部却不是必需 的。利用功能缺失突变体的实验证实在二次生长过程中TDIF-TDR-W0X4对维管束分生组织 的维持起着关键作用。植物GTs对糖的修饰作用与木质部和韧皮部的发育和形成具有密切 的关联性。Persson等在拟南芥突变株中发现随着拟南芥细胞壁中木聚糖的含量下降，将引 起茎维管束和维管束间纤维细胞壁的不平坦而引起木质部坍塌，进而影响木质部的功能发 挥。在白杨树中，木聚糖和甘露糖对次级壁的产生是必须的，而次生木质部的发育与次级壁 又相关联，说明在木质部发育过程中需要相关的糖基转移酶来实现。在稻科植物中，木聚糖 在a-(l，2)-或a-(l，3)-与阿拉伯糖相连，GT61家族蛋白对阿拉伯糖基木聚糖生物合 成起着重要作用。
【发明内容】
[0004] 本发明提供了一种植物维管束发育基因sm-Nvas，将该基因导入至植株中，均导 致转基因植株矮化、茎和叶脉增粗、叶脉增多等表型特征，该基因的核苷酸序列如SEQID NO: 1所示，由1392个碱基组成。该基因所编码的多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNO: 2所 示，由463个氨基酸组成。
[0005] 在抗性鉴定中发现，该基因在水稻中具有增强稻瘟病抗性等特征。因此该植物维 管束发育基因sm-Nvas能够应用于培育抗稻瘟病的水稻品种中，具体包括以下步骤：
[0006] (1)、根据植物维管束发育基因sm-Nvas，构建超量表达载体；
[0007] (2)、利用农杆菌介导的遗传转化将表达载体转入水稻品种，利用甲基茉莉酸和水 杨酸诱导型启动子在植物细胞中诱导表达目的基因；
[0008] (3)、该品种对稻瘟病菌表现出抗菌性。
[0009] 在抗性鉴定中发现，该基因在拟南芥和油菜等农作物中具有菌核病抗性，因此该 植物维管束发育基因sm-Nvas能够应用于培育抗菌核病的农作物品种中，具体包括以下步 骤：
[0010] (1)、根据权利要求1所提供的植物维管束发育基因sm-Nvas，构建超量表达载体；
[0011] (2)、利用农杆菌介导的遗传转化将表达载体转入农作物品种，利用甲基茉莉酸和 水杨酸诱导型启动子在植物细胞中诱导表达目的基因；
[0012] (3)、以上品种对菌核病均表现出抗菌性。
[0013] 本发明在前期工作中发现了一个植株矮化、茎杆增粗、叶脉增多等特征的烟草突 变体。以该突变体为材料克隆了一个新的受茉莉酸甲酯（MeJA)及水杨酸（SA)双重诱导的 UDP-糖基转移酶家族的新成员，细胞学观察和组织特异性研宄结果揭示该基因的生物学功 能与烟草的维管束发育相关。在sm-Nvas超表达的烟草（W38)和拟南芥（Col-0)转基因植 株中，均导致转基因植株矮化、茎和叶脉增粗、叶脉增多等表型特征。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明实施例中所提供的转sm-Nvas基因的拟南芥植株菌核病抗性对照 图；
[0015] 图2为本发明实施例中所提供的转sm-Nvas基因拟南芥植株的基因表达图；
[0016] 图3为本发明实施例中所提供的转sm-Nvas基因水稻稻瘟病抗性对照图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图及具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围 并不局限于以下实施例。
[0018] 本发明实施例中所用的技术，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规 技术；所用的仪器设备、试剂等，除非特别说明，均为本领域的研宄和技术人员可以通过公 共途径获得。
[0019] 1、烟草突变体的获得及鉴定
[0020] 采用的烟草突变体表现出植株矮化、茎杆增粗、叶脉增多等表型；对突变体和野生 型叶脉和茎进行石蜡切片，细胞学观察均显示维管束列数和管状分子数明显增多，维管束 长度和薄壁细胞长度有所缩短，推测该表型的产生与维管束发育有关。
[0021] 2、植物维管束发育基因sm-Nvas的克隆
[0022] 通过差异展示技术从烟草突变体中分离了一个RNA表达水平明显高于野生型 (W38)植株的cDNA序列，利用RACE技术获取了基因的全长cDNA，利用全长cDNA为探针筛 选基因组文库，获取了序列为1392个核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，此基因即为植物维 管束发育基因sm-Nvas，生物信息学预测该基因编码463个氨基酸，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
[0023] 3、植物维管束发育基因sm-Nvas的遗传转化
[0024] (1)转基因培养基配方
[0025] 1)铁盐（Fe2EDTA)贮存液（100X)的配制
[0026] 准备800ml双蒸水并加热至70°C，加入乙二铵四乙酸二钠（Na2EDTA? 2H20)3. 73 克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小时，定容至1000ml，4°C保存备用。
[0027] 2)维生素贮存液（100X)配制
[0028]
【主权项】
1. 一种植物维管束发育基因sm-Nvas，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. -种由权利要求1所述的植物维管束发育基因sm-Nvas编码的多肽片段，其特征在 于：该多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3. 权利要求1所述的植物维管束发育基因sm-Nvas在培育抗稻瘟病的水稻品种中的应 用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于包括以下步骤： (1) 、根据权利要求1所提供的植物维管束发育基因sm-Nvas，构建超量表达载体； (2) 、利用农杆菌介导的遗传转化将表达载体转入水稻品种，利用甲基茉莉酸和水杨酸 诱导型启动子在植物细胞中诱导表达目的基因； (3) 、该品种对稻瘟病菌表现出抗菌性。
5. 权利要求1所述的植物维管束发育基因sm-Nvas在培育抗菌核病的农作物品种中的 应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于包括以下步骤： (1) 、根据权利要求1所提供的植物维管束发育基因sm-Nvas，构建超量表达载体； (2) 、利用农杆菌介导的遗传转化将表达载体转入农作物品种，利用甲基茉莉酸和水杨 酸诱导型启动子在植物细胞中诱导表达目的基因； (3) 、以上品种对菌核病均表现出抗菌性。
【专利摘要】本发明公开了植物维管束发育基因sm-Nvas的核苷酸序列、菌核病和稻瘟病抗性特征及其抗病性在作物育种的应用。该方法包括下列步骤，首先烟草突变体的获得及鉴定；其次是植物维管束发育基因sm-Nvas的克隆；第三是植物维管束发育基因sm-Nvas的遗传转化(受体包括水稻、拟南芥等)；第四是转基因植株抗病性的鉴定(水稻：稻瘟病；拟南芥及油菜：菌核病)；第五是该基因抗病性在作物育种的应用。本发明所涉及核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；拟南芥菌核病抗性特征如附图1所示；水稻稻瘟病抗性特征如附图3所示。
【IPC分类】C07K14-415, C12N15-29, A01H5-00, C12N15-84
【公开号】CN104531723
【申请号】CN201510051757
【发明人】刘学群, 谭艳平, 王春台, 徐鑫, 卢卫
【申请人】中南民族大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月31日