一种灵芝菌株的快速鉴别方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域的分子鉴别方法，具体涉及一种快速鉴别灵芝菌株的方法。
【背景技术】
[0002]灵芝，别称赤芝、红芝、木灵芝、菌灵芝、万年蕈、灵芝草，率属于层菌纲(Hymenomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、灵芝科(Ganodermataceae)、灵芝属(Ganoderma)，拉丁学名为 Ganoderma Lucidum Karst.(Leyss.ex Fr.)，其外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，具有抗肿瘤、护肝、降血脂、降血糖、清除自由基、消炎抗炎、增强免疫和抗病毒等功效。因此，在我国乃至全世界，灵芝都被广泛研宄利用，是少数几个进入最新版药典的大型真菌之一。
[0003]在灵芝的不同菌株之间，无论是菌丝体或子实体，其外观都是基本一致的，难以从外观鉴别开来，这给优质灵芝菌株的知识产权保护带来困扰，同时也让灵芝市场混杂了许许多多以次充好的各类灵芝产品。此外，优质的深加工产品，不仅需要精湛的加工技术，更需要优质的原材料，而优质的菌种，是优质原材料的重要保障。因此，有必要对灵芝菌株进行鉴别，从而区分相同外观下的灵芝是否属于相同菌株。
[0004]目前，灵芝不同菌株之间的鉴别方法主要包括RFLP标记法、RAF1D标记法及AFLP标记法等，其中RFLP标记法需要酶切、制备放射性探针和Southern转移及杂交等步骤，步骤繁杂，工作量大，检测周期长，成本费用高，污染大；RAro标记法存在共迀移问题，并且由于引物短，退火温度低，故该方法的错配几率较大，随机性较强，实验的重复性较差；而AFLP标记法对基因组的纯度和反应条件要求都较高，对模板的反应迟钝，谱带可能发生错配与缺失，并且需要放射性同位素标记，需要较高的实验技能和精密仪器，其技术费用昂贵，技术要求苛刻，另外还存在对DNA的纯度和内切酶的质量要求都较高的问题。
【发明内容】
[0005]针对以上不足，本发明提供一种简单快速、效果可信的鉴别方法，通过该方法对灵芝菌株样品进行快速鉴别，快速得到样品之间是否属于同一菌株的结论。
[0006]本发明通过以下方案达到上述目的:
[0007]一种灵芝菌株的快速鉴别方法，包括以下步骤:
[0008](I)分别取待鉴别的灵芝子实体或菌丝体的样品，进行样品的总DNA提取；
[0009](2)以总DNA为模板，分别进行ITS-PCR及ERIC-PCR ；
[0010](3)对ITS-PCR产物进行测序比对，判定样品是否属于同一菌种；
[0011](4)对ERIC-PCR产物进行电泳检测，以电泳图谱判定样品是否属于同一菌株。
[0012]优选的，上述每个样品的ERIC-PCR在其最适退火温度± 1°C的温度范围内取任一相同退火温度下进行，所述最适退火温度是经过退火温度梯度PCR探索后电泳检测条带多态性最高时的退火温度。ERIC-PCR反应后，将各样品的ERIC-PCR产物进行电泳图谱比较，电泳图谱比较的结果一致即为同一菌株。
[0013]更优选的，上述每个样品的ERIC-PCR在样品共同确定的最适退火温度下进行，所述最适退火温度是所有样品经过退火温度梯度PCR探索后共同确定的电泳检测条带多态性最高时的退火温度，ERIC-PCR反应后，将各样品的ERIC-PCR产物进行电泳图谱比较，电泳图谱比较的结果一致即为同一菌株。
[0014]进一步的，上述鉴别方法中，ITS-PCR的引物为:ITS1:TCC GTA GGT GAA CCT GCGG， ITS4:TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC。
[0015]进一步的，上述鉴别方法中，ERIC-PCR的引物为:ERICR:ATG TAA GCT CCT GGGGAT TCA C，ERIC2:AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G。
[0016]优选的，上述鉴别方法中，ITS-PCR的测序结果显示两样品的ITS序列的相似性达到以上98%时，表明两样品属于同一菌种。
[0017]在一个优选的实施例中，提供了一种灵芝菌株的快速鉴别方法，包括以下步骤:
[0018](I)分别取灵芝子实体的样品，子实体样品掰开后用镊子取菌肉，将菌肉研磨成粉后提取总DNA，或者取灵芝菌丝体的样品，将菌丝体研磨成粉后提取总DNA ;
[0019](2)以总DNA为模板，分别进行ITS-PCR及ERIC-PCR，其中每个样品在其最适退火温度± l°c的温度范围内取任一相同退火温度下进行ERIC-PCR，更优选的为每个样品在最适退火温度下进行ERIC-PCR，所述最适退火温度是所有样品经过退火温度梯度PCR探索后共同确定的电泳检测条带多态性最高时的退火温度；
[0020](3)对ITS-PCR产物进行测序比对，判定样品是否属于同一菌种，两样品之间的ITS序列相似性达到98%以上时，表明两样品属于同一菌种；
[0021](4)对ERIC-PCR的产物进行电泳检测，以电泳图谱判定样品是否属于同一菌株，电泳图谱比较结果一致即为同一菌株。
[0022]在上述的灵芝菌株的快速鉴别方法中，各样品的ERIC-PCR在同一退火温度下进行，该退火温度通常优选取最适退火温度，最适退火温度为各样品经过退火温度梯度PCR探索后电泳检测条带多态性最高时(即条带数最多时)的退火温度，经实验证实在灵芝菌株中该最适退火温度通常为50-55?之间。而发明人在大量灵芝菌株鉴别试验中发现，在最适退火温度±1°C的温度范围内进行的ERIC-PCR的产物的电泳图谱都基本相同，因此，各样品的ERIC-PCR在同一退火温度下进行，该同一退火温度也可优选为最适退火温度±1°C的温度范围内的温度。另外，在发明人以上发现的基础上，各样品的ERIC-PCR也可以在两组或两组以上的退火温度下分别进行，并分别比较各样品在各温度下的ERIC-PCR产物的电泳图谱，只要条带多样性高的同一退火温度下的ERIC-PCR反应的产物的电泳图谱相同即可，因此，通常情况下，只需比较上述一个退火温度下的ERIC-PCR产物电泳图谱，方便简单，并且准确率高。
[0023]在上述的灵芝菌株的快速鉴别方法中，各样品的ERIC-PCR在上述确定的同一退火温度下进行ERIC-PCR后，还可以根据确定最适退火温度时的温度梯度实验，选择其它退火温度进行ERIC-PCR进行辅助判定，只要样品的ERIC-PCR电泳检测条带多态性足够区分各样品即可。
[0024]ITS是rDNA中的内部转录间隔区，ITS区域进化速率较快，序列多态性广泛，序列长度适中，从人类到酵母的各种真核生物中ITS的序列长度为100bp到300bp大小不等，真菌的ITS序列长度一般在650bp?750bp，作为非编码区，它受到的选择压力较小，故相对变化较大，可提供较详细的系统学分析所需的可遗传性状，人们可以从这不太长的序列中获得足够的信息，用于较低水平类群间的系统学研宄。目前ITS-PCR是国际上唯一被公认可用来鉴定至种的分子方法。
[0025]ERIC-PCR是在随机引物PCR(RAPD)的基础上发展起来的对细菌DNA进行指纹图谱分析的一种方法。由于其引物较长(22个寡聚核苷酸)，因此可产生具有较高可重复性和一定特异性的指纹图谱。ERIC片段最初被发现是存在于肠杆菌中的，主要用于原核微生物菌株分类鉴定，发明人在利用ITS-PCR及序列结果分析鉴定到种的基础上，首次利用ERIC-PCR用于灵芝菌株分析，发现ITS-PCR结合ERIC-PCR可用于准确鉴别灵芝菌株，在多种灵芝菌株之间实现成功鉴别。
[0026]因此，针对目前灵芝产业中不同商家的灵芝产品质量参差不齐却难以辨认的普遍现象，本发明针对灵芝的不同菌株之间的小差异探索出一种快速鉴别方法，为灵芝产业优质菌株的保护提供技术参考。
[0027]利用本发明的鉴别方法对灵芝菌株样品之间进行是否属于同一菌株进行鉴别，无需酶切、克隆等繁杂步骤，3天内即得到结论，简单快捷，并且，经实验证实，在超过20多株灵芝菌株样品之间成功实现鉴别，并且反复试验证实鉴别的效果稳定，重复度高，再现性好。
【附图说明】
[0028]图1为实施例5的三个样品的ITS序列的比对图。
[0029]图2为实施例5的三组退火温度下三个样品的ERIC-PCR产物的电泳图谱。
[0030]其中，M为GeneRuler Express DNA ladder ;1、2、3 为 51°C退火温度下的 1、2、3 号样品的ERIC-PCR产物；4、5、6为54°C退火温度下的1、2、3号样品的ERIC-PCR产物；7、8、9为57°C退火温度下的1、2、3号样品的ERIC-PCR产物。
【具体实施方式】
[0031]以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0032]实施例1:
[0033]一种灵芝菌株的快速鉴别方法，包括以下步骤:
[0034](I)分别取待鉴别的灵芝菌丝体样品，进行样品的总DNA提取；
[0035](2)以总DNA为模板，分别进行ITS-PCR及ERIC-PCR ；
[0036](3)对ITS-PCR产物进行测序，判定各样品之间是否属于同一菌种；
[0037](4)对ERIC-PCR产物进行电泳检测，以电泳图谱判定样品之间是否属于同一菌株。
[0038]实施例2
[0039]一种灵芝菌株的快速鉴别方法，包括以下步骤:
[0040](I)分别取待鉴别的灵芝子实体样品，进行样品的总DNA提取；
[0041 ](2)以总DNA为模板，分别进行ITS-PCR及ERIC-PCR ；
[0042](3)对ITS-PCR产物进行测序，得到测序结果(即各样品的ITS序列)，将各样品的ITS序列两两之间进行比对，相似性达到98%以上时，两样品则属于同一菌种，否则，两样品则属于不同菌种；
[0043](4)对ERIC-PCR产物进行电泳检测，得到电泳图谱，将电泳图谱进行两两比较，图谱一致则属于同一菌株，否则，则属于不同菌株。
[0044]实施例3
[0045]一种灵芝菌株的快速鉴别方法，包括以下步骤:
[0046](I)分别取待鉴别的灵芝子实体样品，每种样品各一朵，约50g，掰开后用镊子取菌肉部分，每个样约取菌肉30-50mg，将菌肉分别研磨成粉，利用基因组DNA抽提试剂盒(真菌)对样品进行总DNA提取，提取的总DNA作为以下PCR的DNA模板；
[0047](2)以总DNA为模板，分别进行ITS-PCR及ERIC-PCR ;其中，ERIC-PCR在最适退火温度下进行，最适退火温度通过温度梯度实验确定，电泳检测条带多态性最高时的温度为退火温度；
[0048](3)对ITS-PCR产物进行测序，得到测序结果(即各样品的ITS序列)，将各样品的ITS序列两两之间进行比对，相似性达到98%以上时，两样品则属于同一菌种，否则，两样品则属