花生della基因家族及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及花生DELLA基因家族及其编码基因与应用，特别涉及花生DELLA基因 家族的克隆、表达分析、功能鉴定及其应用，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 赤霉素（gibberellins，简称GAs)作为一种植物激素，在植物的整个生长发育过 程中起着非常重要的调控作用。例如：促进种子萌发、促进茎的伸长和叶的生长、诱导开花 及种子和果实生长等多种生理功能。
[0003] DELLA蛋白是赤霉素信号通路中的抑制因子（参见Fleetetal.CurrentOpinion inPlantBiology, 8 77-85,2005)。赤霉素信号传递途径主要是通过解除DELLA蛋白的抑 制作用来实现的。受体GIDl接收到GA信号后与DELLA蛋白形成GA-GID1-DELLA复合体，随 后被SCF蛋白复合体中的SLYl识别并通过泛素蛋白酶途径降解，DELLA蛋白对植物生长的 抑制作用随即解除，从而调节下游基因的表达（参见Riehardsetal.PlantMolBiol, 52 67-88, 2001；Nakajimaetal.PlantJournal, 46 880-889, 2006；ffilligeetal.The PlantCell, 19 1209-1220,2007)。
[0004] DELLA蛋白属于植物GRAS蛋白家族。拟南芥的GAI (GA Insensitive)、 RGA (Repressor of gal_3)和RGL(RGA like)、水稻的SLRl (Slender Rice I)、小麦的 RhtBl/RhtDl (Reduced height)、大麦的SLNl (Slender I)等都是DELLA蛋白，它们在序 列上高度保守（参见Vandenbussche et al. BMC Plant Biol,7 65,2007)。DELLA蛋白 的N端具有保守的DELLA结构域（包括DELLA和VHYNP两个酸性基序），是与受体GIDl 蛋白的结合结构域，对响应GA信号的DELLA蛋白降解具有重要作用。C端具有保守的 GRAS结构域，是DELLA蛋白的功能结构域，在调控DELLA蛋白活性方面起作用。DELLA 结构域的缺失将使DELLA蛋白不能被降解，而使植物表现出类似于GA缺陷型突变体 gal-3的表型，而它们在GRAS功能结构域中的缺失突变会造成植株徒长的表型（参见 Dill et al. PNAS,98(24) 14162-14167,2001；Chandler et al.Plant Physiology,129 181-190, 2002;Wen et al. The Plant Cell,14 87-100,2002)。
[0005] 水稻和大麦中只有一个DELLA蛋白，能够抑制几乎所有GA控制的生长发育过 程。而拟南芥中有五个DELLA蛋白，包括GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3,它们的功能既相 互重叠又各有不同（参见Cheng et al. Development, 131 1055-1064,2004)。例如RGA、 GAI和RGLl都具有抑制茎伸长的作用（参见Dill et al. Genetics, 159 777-785, 2001 ; Wen et al.Plant Cell，14 87-100,2002) ;RGA、RGLl和RGL2都具有抑制成花和种子 形成的作用（参见Ueguchi-Tanaka et al. Annu Rev Plant Biol, 58 183-198,2007); RGA、GAI、RGL2和RGL3在种子萌发中具有抑制作用（参见Peng et al. Curr Opin Plant Biol，5 376?381，2002;Caoetal.Planta，223:105?113,2005;Ariizumietal.Plant Cell,19:791?804, 2007)。
[0006] DELLA蛋白除了对植物生长发育具有抑制作用外，还有其他重要功能。DELLA蛋 白在调控果实发育方面有重要作用。例如番茄中S1DELLA基因的沉默导致未受精的情况 下发生单性结实，推测DELLA的表达很可能是受精前子房发育暂停的原因（参见Cristina etal.ThePlantJournal, 52 865 - 876,2007)。DELLA蛋白在多种植物激素信号和环境 信号的传递途径中也具有调节作用（参见Achardetal.Science, 311:91?94,2006)。 例如，光通过降低GA的生物合成水平促进DELLA蛋白的积累，抑制PIF3转录因子与它 的靶基因启动子结合，使拟南芥下胚轴伸长受到抑制。而黑暗下相反，DELLA蛋白的降解 促进下胚轴伸长（参见Fengetal.Nature，451 475_478,2008;Achardetal.Plant Physiology，1431163-1172, 2007)。DELLA蛋白还在植物耐逆境胁迫方面起作用。通过研宄 拟南芥在植物激素处理条件下和逆境胁迫下的DELLA蛋白变化，结果表明DELLA蛋白对植 物生长的抑制是有益的，它能够依据外界的变化，实时地调控植物生长，从而提高植物的抗 逆性（Achardetal.PlantPhysiol, 143 1163-1172,2007)。由此可见，DELLA蛋白在植物 整个的生长发育过程中发挥着至关重要的作用。
[0007] 花生是我国重要的油料作物之一，我国花生总产占全国油料作物总产量的1/2。然 而，我国花生产业仍面临着十分严峻的问题，花生产量和胁迫抗性的进一步提高仍然是我 国花生品种培育的最重要课题。加大生物技术在种质创新和品种培育中的力度是实现我 国花生品种改良新飞跃的关键。然而，由于对花生重要农艺性状形成的分子机理知之甚少， 花生的分子生物学研宄也远落后于其他农作物。鉴定花生中的DELLA基因家族，研宄不同 DELLA蛋白在花生生长发育和抵御胁迫中的作用机理，对阐明决定花生高产、抗逆性状的分 子基础具有重要意义。
【发明内容】
[0008] 本发明针对现有技术的不足，提供花生DELLA蛋白基因家族及其编码基因与应 用。
[0009] 一种花生AhDELLAl蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0010] 编码花生AhDELLAl蛋白的基因，核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0011] 一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示的编码花生AhDELLAl蛋白 的基因。该重组载体可通过购买市售的载体，经过常规手段，将目的基因SEQ ID NO. 2导入 载体，即可获得含有SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的重组载体。
[0012] 一种重组细胞，含有上述编码花生AhDELLAl蛋白的基因或者上述重组载体。
[0013] 上述编码花生AhDELLAl蛋白的基因、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他 经济作物抗逆中的应用。
[0014] 一种花生AhDELLA2蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0015] 编码花生AhDELLA2蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0016] 一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示的编码花生AhDELLA2蛋白 的基因。该重组载体可通过购买市售的载体，经过常规手段，将目的基因SEQ ID NO. 4导入 载体，即可获得含有SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列的重组载体。
[0017] -种重组细胞，含有上述编码花生AhDELLA2蛋白的基因或者上述重组载体。
[0018] 上述编码花生AhDELLA2蛋白的基因、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他 经济作物抗逆中的应用。
[0019] 有益效果
[0020] 本发明首次发现了花生DELLA蛋白基因家族AhDELLAl和AhDELLA2及其编码基 因。通过分析AhDELLAl和AhDELLA2基因在花生不同组织以及在不同胁迫处理下的表达 变化，发现AhDELLAl和AhDELLA2在花生生长发育过程和胁迫响应中起重要作用；为阐明 DELLA基因家族调控花生生长发育和胁迫响应的分子机理提供了重要的理论依据，并且在 抗逆花生新品种培育方面具有重要指导意义，为利用转基因技术创新作物新种质奠定了基 础。
【附图说明】
[0021] 图UAhDELLA基因家族蛋白与几种不同物种来源的DELLA蛋白的同源性比较；
[0022] 其中：At:拟南芥；Ta:小麦；Gm:大豆；Hv:大麦；Os:水稻；Re:蓖麻；Ps:豌豆； Ah:花生；
[0023]所选择蛋白登录号：AtGAI:NM_101361.2;AtRGLl:NM_105306.3; AtRGA:NM_126218. 2 ；AtRGL2:NM_111216. 2 ；AtRGL3:NM_121755. 2JaRht-Al:GQ451333.I； TaRHT-Dl:GQ451334.I；TaRht-BI:KC434I35.I；GmGAII:NM_00I254019.I； GmGAI1-1:XM_003552932.I；GmGAI2:XM_003538347.I；GmRGA2-lI:XM_003535403.I； GmRGA2-12:XM_00353 1 105.I；HvSLNI:AF4602I9.I；OsSLRl:AB262980.I； RcGAIP-B:XP_002527794.I；PsDELLA:DQ848351.I；
[0024] 图2、荧光定量PCR分析AhDELLA基因家族在花生不同组织中的表达量的柱状图；
[0025]其中：a、AhDELLAl;b、AhDELLA2 ;c、AhDELLA3 ;d、AhDELLA4 ;
[0026]JS幼年茎（15天），AS成年茎（40天），JL幼年叶片（15天），AL成年叶片（40 天），JR根，F花，Gl未入土的果针，G2入土 3天的果针，G3入土 9天的果针，S未成熟种子。
[0027] 图3、荧光定量PCR分析AhDELLA基因家族在模拟干旱胁迫下的表达变化的柱状 图；
[0028]其中：a、AhDELLAl;b、AhDELLA2 ;c、AhDELLA3 ;d、AhDELLA4 ;
[0029] 图4、荧光定量PCR分析AhDELLA基因家族在高盐胁迫下的表达变化的柱状图；
[0030]其中：a、AhDELLAl;b、AhDELLA2 ;c、AhDELLA3 ;d、AhDELLA4 ;
[0031] 图5、植物表达载体pCAMBIA2300-AhDELLAl的构建过程示意图；
[0032] 图6、通过PCR分子检测法，对AhDELLAl转基因烟草的鉴定；
[0033] 其中：1-8、AhDELLAl转基因烟草植株，经PCR显示为阳性，为转基因植株；9、质粒 阳性对照；10、野生型烟草阴性对照；M、MarkerDL5000(购自TaKaRa公司）；
[0034] 图7、转AhDELLA基因烟草与野生型烟草成苗期表型对比；
[0035] 其中WT:野生型烟草。
[0036] 图8、转AhDELLA基因烟草与野生型烟草衰老期表型对比；
[0037] 其中WT:野生型烟草。 具体实施方案
[0038] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0039]生物材料来源：
[0040] 烟草品种SRl购自山东鲁生生