花生della基因家族及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及花生DELLA基因家族及其编码基因与应用，特别涉及花生DELLA基因 家族的克隆、表达分析、功能鉴定及其应用，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 赤霉素（gibberellins，简称GAs)作为一种植物激素，在植物的整个生长发育过 程中起着非常重要的调控作用。例如：促进种子萌发、促进茎的伸长和叶的生长、诱导开花 及种子和果实生长等多种生理功能。
[0003]DELLA蛋白是赤霉素信号通路中的抑制因子（参见Fleetetal.CurrentOpinion inPlantBiology, 877-85, 2005)。赤霉素信号传递途径主要是通过解除DELLA蛋白的 抑制作用来实现的。受体GID1接收到GA信号后与DELLA蛋白形成GA-GIDI-DELLA复 合体，随后被SCF蛋白复合体中的SLYl识别并通过泛素蛋白酶途径降解，DELLA蛋白对 植物生长的抑制作用随即解除，从而调节下游基因的表达（参见Riehardsetal.Plant MolBiol,5267-88, 2001；Nakajimaetal.PlantJournal, 46880-889, 2006；ffilligeet al.ThePlantCell, 191209-1220, 2007)。
[0004] DELLA蛋白属于植物GRAS蛋白家族。拟南芥的GAI(GAInsensitive)、 RGA(Repressorofgal_3)和RGL(RGAlike)、水稻的SLRl(SlenderRice1)、小麦 的RhtBl/RhtDl(Reducedheight)、大麦的SLNl(SlenderI)等都是DELLA蛋白，它们 在序列上高度保守（参见Vandenbusscheetal.BMCPlantBiol, 765, 2007)。DELLA 蛋白的N端具有保守的DELLA结构域（包括DELLA和VHYNP两个酸性基序），是与受 体GIDl蛋白的结合结构域，对响应GA信号的DELLA蛋白降解具有重要作用。C端具 有保守的GRAS结构域，是DELLA蛋白的功能结构域，在调控DELLA蛋白活性方面起作 用。DELLA结构域的缺失将使DELLA蛋白不能被降解，而使植物表现出类似于GA缺 陷型突变体gal-3的表型，而它们在GRAS功能结构域中的缺失突变会造成植株徒长 的表型（参见Dilletal.PNAS, 98 (24) 14162-14167, 2001;Chandleretal.Plant Physiology, 129181-190, 2002;Wenetal.ThePlantCell, 1487-100, 2002)〇
[0005] 水稻和大麦中只有一个DELLA蛋白，能够抑制几乎所有GA控制的生长发育过程。 而拟南芥中有五个0￡〇^蛋白，包括641、1^^、1?11、1?12和1?13，它们的功能既相互重叠又 各有不同（参见Chengetal.Development, 1311055-1064, 2004)。例如RGA、GAI和RGLl都 具有抑制茎伸长的作用（参见Dilletal.Genetics, 159777-785, 2001;Wenetal.Plant Cell, 1487-100, 2002) ;RGA、RGLl和RGL2都具有抑制成花和种子形成的作用（参见 Ueguchi-Tanakaetal.AnnuRevPlantBiol，58183-198,2007) ;RGA、GAI、RGL2和RGL3在 种子萌发中具有抑制作用（参见Pengetal.CurrOpinPlantBiol, 5376 ?381，2002;Cao etal.Planta，223:105 ?113,2005;Ariizumietal.PlantCell, 19:791 ?804,2007)〇
[0006] DELLA蛋白除了对植物生长发育具有抑制作用外，还有其他重要功能。DELLA蛋 白在调控果实发育方面有重要作用。例如番茄中S1DELLA基因的沉默导致未受精的情况 下发生单性结实，推测DELLA的表达很可能是受精前子房发育暂停的原因（参见Cristina etal.ThePlantJournal, 52865 - 876, 2007)。DELLA蛋白在多种植物激素信号和环境 信号的传递途径中也具有调节作用（参见Achardetal.Science, 311:91?94,2006)。 例如，光通过降低GA的生物合成水平促进DELLA蛋白的积累，抑制PIF3转录因子与它 的靶基因启动子结合，使拟南芥下胚轴伸长受到抑制。而黑暗下相反，DELLA蛋白的降 解促进下胚轴伸长（参见Fengetal.Nature, 451475-478, 2008;Achardetal.Plant Physiology，1431163-1172, 2007)。DELLA蛋白还在植物耐逆境胁迫方面起作用。通过研宄 拟南芥在植物激素处理条件下和逆境胁迫下的DELLA蛋白变化，结果表明DELLA蛋白对植 物生长的抑制是有益的，它能够依据外界的变化，实时地调控植物生长，从而提高植物的抗 逆性（Achardetal.PlantPhysiol, 1431163-1172, 2007)。由此可见，DELLA蛋白在植物 整个的生长发育过程中发挥着至关重要的作用。
[0007] 花生是我国重要的油料作物之一，我国花生总产占全国油料作物总产量的1/2。然 而，我国花生产业仍面临着十分严峻的问题，花生产量和胁迫抗性的进一步提高仍然是我 国花生品种培育的最重要课题。加大生物技术在种质创新和品种培育中的力度是实现我 国花生品种改良新飞跃的关键。然而，由于对花生重要农艺性状形成的分子机理知之甚少， 花生的分子生物学研宄也远落后于其他农作物。鉴定花生中的DELLA基因家族，研宄不同 DELLA蛋白在花生生长发育和抵御胁迫中的作用机理，对阐明决定花生高产、抗逆性状的分 子基础具有重要意义。
【发明内容】
[0008] 本发明针对现有技术的不足，提供花生DELLA蛋白基因家族及其编码基因与应 用。
[0009] 一种花生AhDELLA3蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO. 5所示。
[0010] 编码花生AhDELLA3蛋白的基因，核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示。
[0011] 一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示的编码花生AhDELLA3蛋白 的基因。该重组载体可通过购买市售的载体，经过常规手段，将目的基因SEQ ID NO. 6导入 载体，即可获得含有SEQ ID NO. 6所示核苷酸序列的重组载体。
[0012] 一种重组细胞，含有上述编码花生AhDELLA3蛋白的基因或者上述重组载体。
[0013] 上述编码花生AhDELLA3蛋白的基因、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他 经济作物抗逆中的应用。
[0014] 一种花生AhDELLA4蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0015] 编码花生AhDELLA4蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
[0016] 一种重组载体，插入了核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示的编码花生AhDELLA4蛋白 的基因。该重组载体可通过购买市售的载体，经过常规手段，将目的基因SEQ ID NO. 8导入 载体，即可获得含有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的重组载体。
[0017] -种重组细胞，含有上述编码花生AhDELLA4蛋白的基因或者上述重组载体。
[0018] 上述编码花生AhDELLA4蛋白的基因、重组载体和/或重组细胞在改良花生或其他 经济作物抗逆中的应用。
[0019] 有益效果
[0020] 本发明首次发现了花生DELLA蛋白基因家族AhDELLA3和AhDELLA4及其编码基 因。通过分析AhDELLA3和AhDELLA4基因在花生不同组织中的表达变化，发现AhDELLA3和 AhDELLA4基因在花生荚果发育过程中起到重要的作用；为阐明DELLA基因家族调控花生 生长发育的分子机理提供了重要的理论依据，并且在花生新品种培育方面具有重要指导意 义，为利用转基因技术创新作物新种质奠定了基础。
【附图说明】
[0021] 图UAhDELLA基因家族蛋白与几种不同物种来源的DELLA蛋白的同源性比较；
[0022] 其中：At:拟南芥；Ta:小麦；Gm:大豆；Hv:大麦；Os:水稻；Re:蓖麻；Ps:豌豆； Ah:花生；
[0023]所选择蛋白登录号：AtGAI:NM_101361.2;AtRGLl:NM_105306.3; AtRGA:NM_126218. 2 ；AtRGL2:NM_111216. 2 ；AtRGL3:NM_121755. 2JaRht-Al:GQ451333.I； TaRHT-Dl:GQ451334.I；TaRht-BI:KC434I35.I；GmGAII:NM_00I254019.I； GmGAI1-1:XM_003552932.I；GmGAI2:XM_003538347.I；GmRGA2-lI:XM_003535403.I； GmRGA2-12:XM_00353 1 105.I；HvSLNI:AF4602I9.I；OsSLRl:AB262980.I； RcGAIP-B:XP_002527794.I；PsDELLA:DQ848351.I；
[0024] 图2、荧光定量PCR分析AhDELLA基因家族在花生不同组织中的表达量的柱状图；
[0025]其中：a、AhDELLAl;b、AhDELLA2 ;c、AhDELLA3 ;d、AhDELLA4 ;
[0026] JS幼年茎（15天），AS成年茎（40天），JL幼年叶片（15天），AL成年叶片（40 天），JR根，F花，Gl未入土的果针，G2入土3天的果针，G3入土9天的果针，S未成熟种子。
[0027] 图3、荧光定量PCR分析AhDELLA基因家族在模拟干旱胁迫下的表达变化的柱状 图；
[0028]其中：a、AhDELLAl;b、AhDELLA2 ;c、AhDELLA3 ;d、AhDELLA4 ;
[0029] 图4、荧光定量PCR分析AhDELLA基因家族在高盐胁迫下的表达变化的柱状图；
[0030]其中：a、AhDELLAl;b、AhDELLA2 ;c、AhDELLA3 ;d、AhDELLA4 ;
[0031] 图5、植物表达载体pCAMBIA2300-AhDELLAl的构建过程示意图；
[0032] 图6、通过PCR分子检测法，对AhDELLAl转基因烟草的鉴定；
[0033] 其中：1-8、AhDELLAl转基因烟草植株，经PCR显示为阳性，为转基因植株；9、质粒 阳性对照；10、野生型烟草阴性对照；M、MarkerDL5000(购自TaKaRa公司）；
[0034] 图7、转AhDELLA基因烟草与野生型烟草成苗期表型对比；
[0035] 其中WT:野生型烟草。
[0036] 图8、转AhDELLA基因烟草与野生型烟草衰老期表型对比；
[0037] 其中WT:野生型烟草。 具体实施方案
[0038] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0039] 生物材料来源：
[0040] 烟草品种SRl购自山东鲁生生物科技有限公司；
[0041] 鲁花14号、仲恺1号花生种子