一种饱和氯化钠法快速批量提取血液dna的试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种饱和氯化钠法快速提取血液DNA的试 剂盒，还涉及用此试剂盒从血液样品中提取DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 不同来源的材料因材料起始量、细胞结构及其成分的不同，所提取的基因组DNA 有很大差异。因此，充足的材料起始量对提取足够用于后续实验的基因组DNA非常关键。很 多动物学实验中，通过采集少量的动物血液就可以获得大量的基因组DNA，而且采集方式快 速，从而进行很多的分子遗传育种研宄。因此，血液样品的基因组DNA的有效提取成为实现 上述领域的目标的关键性步骤。
[0003] 目前，提取血液DNA基因组的方法各式各样，但是大部分需要频繁使用有毒试剂 (如苯酚、氯仿、异戊醇），而且容易带来安全问题。现在常用的基因组DNA分离纯化方法是 SDS/苯酚/氯仿抽提法，该方法在提取各种材料的基因组DNA时具有一些本身的优点，但 该方法存在提取少量血液样品时面临无法有效提取DNA、操作步骤非常繁琐等缺点。针对 以上分离纯化技术的问题，现在分离纯化DNA大都采用离心柱法，即通过内嵌玻璃纤维素 膜吸附从样品中裂解出的DNA，漂洗杂质后再将DNA洗脱下来。离心柱法虽然能够提取DNA 并保证其纯度，但是其提取的DNA产量普遍不高，无法满足大批量动物分子遗传分析、法医 检测、考古分析和医学检测等领域的要求。此外，离心柱法使用到一些有毒试剂，如苯酚、氯 仿等，不利于实验人员的身体健康；同时，离心柱法在整个提取DNA的过程中耗时较多，影 响了下一歩分析检测的速度。
[0004] 作为相对安全且效果足够好的饱和氯化钠法提取血液基因组DNA的方法却没有 专用试剂盒，于是我们基于饱和氯化钠法去除蛋白质从而快速提取血液DNA而发明了本试 剂盒。
【发明内容】
[0005] 为了使血液基因组DNA提取变得更简便、快捷，本发明提供一种饱和氯化钠法快 速批量提取血液DNA的试剂盒，以便于实验过程能够节省更多的时间和人力。本发明的另 一个目的在于提供一种使用试剂盒从血液样品中大批量快速提取DNA的方法，该方法耗时 短，不使用有毒试剂，所提DNA含量和纯度较高。
[0006] 本发明中，饱和氯化钠法快速批量提取血液DNA的试剂盒，包括红细胞裂解液、去 蛋白液、蛋白沉淀液、调节结合液、洗脱液和蛋白酶K溶液；
[0007] 其中，所述红细胞裂解液包含8. 29g/L的NH4Cl，31g/L的KHCO#P 0. 37g/L的 Na2EDTA, pH 7. 2-7. 4 ;所述去蛋白液为10% SDS ;所述去蛋白沉淀液为饱和NaCl ;所述调节 结合液为异丙醇；所述洗脱液为70%乙醇；所述蛋白酶K溶液浓度为20mg/l。
[0008] 本发明所述红细胞裂解液主要用于裂解红细胞释放胞内物质；所述蛋白酶K和去 蛋白液10% SDS主要作用是裂解细胞膜、核膜，使核膜里与蛋白质结合的核酸释放到溶液 里面，10% SDS能有效的去除蛋白质，并且保证基因组DNA不会损失；所述蛋白沉淀液饱和 NaCl主要用于沉淀和去除蛋白质组分；所述调节结合液异丙醇主要用于沉淀基因组DNA ; 所述洗脱液70%乙醇主要用于洗涤沉淀DNA并去除残留的一些其他杂质，从而纯化基因组 DNA。使用时能有效减少操作时间，突出了更快更高效提取血液基因组DNA的的理念。
[0009] 本发明还提供一种用所述试剂盒快速批量提取血液DNA的方法，包括以下步骤：
[0010] (1)裂解细胞：在血液样品中加入所述红细胞裂解液，所述蛋白酶K溶液，所述去 蛋白液，充分混匀，放入水浴锅中56°c左右消化；
[0011] 其中，优选的，所述血液样品与所述红细胞裂解液的体积比为1 :40,所述红细胞 裂解液、所述蛋白酶K溶液和所述去蛋白液的体积比为20-30 :1-1. 5 :8-10。
[0012] (2)沉淀蛋白质：向已消化完成的血液样品中加入所述去蛋白沉淀液，震荡摇匀 后，离心，留上清液；
[0013] (3)沉淀DNA :将所述上清液中加入所述调节结合液，摇匀离心，弃上清液留DNA沉 淀；
[0014] (4)纯化DNA :将所述DNA沉淀用所述洗脱液洗涤，洗涤干净后，离心得DNA样品。 作为优选的，所述DNA沉淀用所述洗脱液重复洗涤。
[0015] 优选的，该提取方法提取的DNA风干，并用双蒸水或IXTE缓冲液溶解，于 4°〇、-20°〇或_80°〇冰箱保存备用。
[0016] 优选的，本发明中离心条件为12000rpm，4°C离心lOmin。
[0017] 本发明所述方法采用饱和氯化钠法，通过红细胞裂解液、蛋白酶K(20mg/ml)、 去蛋白液、蛋白沉淀液、调节结合液和洗脱液从血液样品中快速提取基因组DNA。其中， SDS(十二烷基硫酸钠）是阴离子表面活性剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而 沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再加入饱和氯化钠溶剂，能使蛋白质变性并沉淀下来， 因核酸（DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质， 液相的分离变得十分快捷方便。去除蛋白质的上清液中加入异丙醇使得DNA沉淀，经过乙 醇洗涤、纯化并沉淀DNA，沉淀的DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即得到了 DNA溶液，因此本方 法通过简单的洗脱就可以得到所提DNA。
[0018] 所述蛋白沉淀液为饱和NaCl，运用了高浓度盐使蛋白质变性并析出的原理，能很 有效的去除蛋白质。
[0019] 所述去蛋白液SDS，它是一种离子型表面活性剂。它主要功能有：（1)溶解细胞膜 上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2)解聚细胞中的核蛋白。（3)SDS能与 蛋白质结合成为R-0-S03-…R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
[0020] DNA保存时，可以用100-200ul H2O或者1XTE，1XTE相对更好一些，在基因操 作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷 酸盐缓冲系统（PKa = 7. 2)和硼酸系统（pKa = 9. 24)等虽然也都符合细胞内环境的生 理范围（pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca 2+产 生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求 高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCKpKa = 8. 0)的缓冲系统，由于缓冲液是 Tris-HCl，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统， TE缓冲液中的EDTA更能螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作 用。
[0021] 采用本发明所述从微量血液样品中提取基因组DNA的试剂盒及方法，所提DNA含 量高、纯度高，操作方便，不需要很多帮助就能轻松完成，提取速度快，不采用有毒试剂，并 且所用试剂价格普遍不高（如NaCl，乙醇等等），容易获得，容易配制，并对提取的基因组 DNA进行PCR扩增检测，提取的血液DNA能够满足后续的很多分子生物学实验的要求。本发 明特殊之处在于使用氯化钠非常容易购买到，而且十分便宜，配制的饱和氯化钠溶液的方 法也很简单，在50ml水中一直加入氯化钠直到氯化钠不再溶解即配制而成。
【附图说明】
[0022] 图1是从鸡血液中利用饱和氯化钠法快速提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0023] 其中，泳道M为DNA分子量Marker，从上至下依次为，100，250，500，750，1000， 2000Marker ；
[0024] 泳道1-6为本发明利用饱和氯化钠试剂盒从鸡血液中提取的基因组DNA条带。
[0025] 图2是从林麝血液中利用饱和氯化钠法快速提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳 图；
[0026] 其中，泳道M为DNA分子量Marker，从上至下依次为，100，250，500，750，1000， 2000Marker ；
[0027] 泳道1-6为本发明利用饱和氯化钠试剂盒从林麝血液中提取的基因组DNA条带。
[0028] 图3是从鸡动物血液中提取的基因组DNA用于扩增鸡线粒体控制区（D-loop， 816bp)序列的琼脂糖凝I父电泳图；
[0029] 其中，泳道M为DNA分子量Marker，从上至下依次为100,250,500,750，1000， 2000Marker ；
[0030] 泳道1-6为本发明利用饱和氯化钠法从鸡血液中提取的基因组DNA经过PCR扩增 得到的鸡线粒体控制区（D-loop，816bp)条带。
【具体实施方式】
[0031] 下面将结合本发明中的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基 于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032] 实施例1
[0033] 此发明专利所述从血液中快速提取基因组DNA的试剂盒中包含红细胞裂解液、去 蛋白液、蛋白沉淀液、调节结合液、洗脱液和20mg/ml蛋白酶K溶液。
[0034] 红细胞裂解液包含NH4Cl, KHCOjP Na 2EDTA，pH 7. 2-7. 4 ;具体配制方法！NH4Cl 8. 29g,