I型胶原α1链的新应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及I型胶原〇 1链的新应用，具体地说，本发明涉及I型胶原〇 1链在诊 断非小细胞肺癌中的应用及I型胶原a1链的拮抗剂在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应 用。
【背景技术】
[0002] I型胶原由2个a1链和1个a2链组成，I型胶原a1链和a2链的编码基因 为C0L1A1和C0L1A2。C0L1A1基因定位于17q21. 3_q22,由51个外显子组成，基因全长 18kb。现有研究表明，90%以上的成骨不全患者具有I型胶原基因（C0L1A1，C0L1A2)突 变，尤以COL1A1基因突变为主。I型胶原基因突变的位点与成骨不全临床表型有一定 相关性（Hartikka,H.，etal. ,LackofcorrelationbetweenthetypeofCOLlAlor C0LlA2mutationandhearinglossinosteogenesisimperfectapatients.Human mutation, 2004. 24(2) :p. 147-154 ;)。另有报道显示，I型胶原过度增加导致肝内ECM合成 和沉积过多，最终可能导致肝纤维化。此外，有报道称C0L1A1在乳腺癌的发生、发展过程中 存在异常表达，并且可能与肿瘤细胞的增殖和迁移以及肿瘤患者的预后相关。
[0003] 肺癌是我国乃至世界范围内最常见且致死率最高的恶性肿瘤之一，其中约80%的 患者为非小细胞肺癌（non-smallcelllungcarcinomas,NSCLC)。据统计在每年的新增 病例中约75%的患者确诊时己处于进展期，平均生存时间仅10个月。降低肺癌死亡率必须 加强肺癌早期诊断并有效治疗肺癌，而加强肺癌的早期诊断必须要尽可能多的找到与肺癌 发生、发展密切相关的诊断标志物。
[0004] 高通量测序类型分为多种，基因芯片、基因深度测序（genomere-sequencing)、转 录组深度测序（transcriptomere-sequencing又称RNA-Seq)等，在转录组研究中应用最 早及最广泛的为基因芯片技术，随着高通量测序技术的发展，实验研究产生了大量的基因 芯片数据，并通过基因表达芯片来筛选出影响疾病发生发展的基因及信号通路，已鉴别出 大量差异表达的基因。但是不同的实验平台及样本的差异导致各个基因芯片的分析结果存 在很多不一致性，Meta分析可对同一个问题所发表相关研究报告的结果进行收集、统计上 的整合，以期获得更准确或更多的结果。这个分析能产生很多显著的差异表达基因，能避免 单个研究带来的不正确性。
[0005] 本发明中发明人通过对15套肺腺癌基因芯片的结果进行归一化处理后进行 t-test，筛选差异表达基因，共筛选出1063个差异表达基因，其中表达水平上调的基因464 个，表达水平下调的基因599个。为了更好的研究差异表达基因的功能，我们通过DAVID对 差异表达基因进行G0功能富集和KEGG通路富集。KEGG通路富集的结果显示37个基因能 够在KEGG库中筛出，集中在粘着斑这个信号通路，可能与肺腺癌的转移相关。基于我们的 研究方向，我们挑选C0L1A1作为候选基因进行经典的分子生物学实验验证。通过对候选基 因的进一步分子生物学验证，证实了C0L1A1在肺腺癌中高表达，同时C0L1A1与非小细胞肺 癌具有很好的相关性，可用于制备肺腺癌辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供了C0L1A1在制备肺腺癌诊断制剂中的新用途。
[0007] 发明人对已发表的15套肺腺癌基因芯片的结果进行Meta分析，获得1063个差异 表达基因，其中表达水平上调的基因464个，表达水平下调的基因599个，并利用KEGG、G0、 0MM等各种生物学信息数据库和MATLAB等分析工具对差异表达基因进行功能分析，进而 筛选出影响肺腺癌发生发展的关键基因和重要的信号通路，另外基于数据挖掘分析的结果 和我们的研究方向，筛选出候选基因C0L1A1。进而，本发明通过荧光定量PCR方法在5例肺 腺癌患病病人的癌组织和5例正常组织为样本验证筛选到的肺腺癌致病基因C0L1A1在肺 腺癌患病病人的癌组织和正常组织的表达情况，结果显示C0L1A1在肺腺癌患病病人的癌 组织中表达均显著上升。
[0008] 本发明目的是提供了一种肺腺癌检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测C0L1A1蛋 白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0009] 进一步，所述检测试剂盒为检测C0L1A1蛋白的ELISA检测试剂盒。所述试剂盒中 的抗体可采用市售的C0L1A1单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被C0L1A1单克隆 抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终 止液等，优选HRP标记的IgG抗体、辣根过氧化物酶。
[0010] 进一步，所述检测试剂盒为检测C0L1A1蛋白的胶体金检测试剂盒，所述的抗体可 采用市售的C0L1A1单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技 术或胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点 有抗C0L1A1单克隆抗体、质控区（C)喷点有羊抗鼠免疫球蛋白IgG。
[0011] 本发明目的是提供了一种肺腺癌检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测C0L1A1基 因。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0012] 进一步，所述的检测试剂盒为检测上述C0L1A1表达水平的荧光定量PCR试剂盒。 优选采用引物对为SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2。
[0013] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪， 灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0014] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、荧光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDN0. 1， 下游引物序列为SEQIDNO. 2。所述内参引物为P-actin内参引物，上游引物序列为SEQ IDNO. 3,下游引物序列为SEQIDNO. 4。
[0015] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。优选TRIzol?Reagent进行样本RNA提取。
[0016] 本发明还检测了本试剂盒灵敏性，结果显示本试剂盒检测范围为106-10 2c〇pieS/ U1，最小检出浓度为lOOcopies/ii1。
[0017] 本发明目的是提供C0L1A1基因和/或C0L1A1蛋白在制备肺腺癌的诊疗产品中的 应用。
[0018] 本发明首先分别提取了 5例肺腺癌患病病人的癌组织和5例正常组织，对其总RNA 的进行提取，设计了用于扩增C0L1A1基因的2条引物SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2,用于扩 增内参基因0-actin的2条引物SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4。制备了含有C0L1A1基因 序列的标准DNA模板，并进行了敏感性实验。进而，采用qRT-PCR的方法比较C0L1A1基因 在肺腺癌组织和正常组织中的表达水平。结果表明：qRT-PCR扩增结果稳定，其中C0L1A1在 正常组织中的表达水平明显高于肺腺癌癌组织，实验结果验证了生物信息学筛选结果。进 一步，发明人在134例肺腺癌患病病人的癌组织及癌旁组织中检测C0L1A1基因表达情况， 结果显示133例肺腺癌患病病人的癌组织中C0L1A1基因表达高于癌旁组织中的表达，检出 准确率达99%，即C0L1A1基因与肺腺癌具有很好的相关性，可用于制备肺腺癌辅助诊断或 者治疗制剂。
【附图说明】
[0019] 图1C0L1A1基因荧光定量扩增曲线图
[0020] 图2C0L1A1基因荧光定量溶解曲线图
[0021] 图3C0L1A1基因在癌组织及正常组织中相对表达量图
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0023] 实施例1肺腺癌高通量转录组数据Meta分析
[0024] 我们对已报道的15套肺腺癌基因芯片的结果进行归一化处理后进行t-test，筛 选差异表达基因，共筛选出1063个差异表达基因，其中表达水平上调的基因464个，表达水 平下调的基因599个。为了更好的研究差异表达基因的功能，我们通过DAVID对差异表达 基因进行G0功能富集和KEGG通路富集。KEGG通路富集的结果显示37个基因能够在KEGG 库中筛出（见表1)，集中在粘着斑这个信号通路，可能与肺腺癌的转移相关。基于我们的研 究方向，挑取C0L1A1作为候选基因进行经典的分子生物学实验验证。
[0025] 表1差异表达基因富集的信号通路
[0026]
【主权项】
1. COLlAl基因在制备肺腺癌的诊疗制剂中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肺腺癌的诊疗制剂包括用荧光定 量PCR方法、基因芯片方法检测肺腺癌中COLlAl基因。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的用于荧光定量PCR方法检测肺腺 癌中COLlAl基因的产品含有一对特异性扩增COLlAl基因的引物；所述的基因芯片包括与 COLlAl基因的核酸序列杂交的探针。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述一对特异性扩增COLlAl基因的引物 上游引物序列为SEQ ID NO. 1，下游引物序列为SEQ ID NO. 2。 5. I型胶原a 1链在制备肺腺癌的诊疗制剂中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肺腺癌的诊疗制剂包括用免疫方法 检测肺腺癌中I型胶原α 1链。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述用免疫方法检测肺腺癌的产品包括 与I型胶原α1链特异性结合的抗体。
8. 根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述免疫方法检测肺腺癌中I型胶原 a 1链的产品为ELISA检测试剂盒和/胶体金检测试剂盒。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述ELISA检测试剂盒包括：包被抗 COLlAl单克隆抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗 涤液，酶反应终止液。
10. -种检测肺腺癌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测基因 C0L1A1，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO. 1，下游引物序列为 SEQ ID NO. 2。
【专利摘要】本发明涉及I型胶原α1链的新应用，具体涉及I型胶原α1链在诊断非小细胞肺癌中的应用及I型胶原α1链的拮抗剂在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。所述COL1A1在肺腺癌中高表达，同时COL1A1与非小细胞肺癌具有很好的相关性，可用于制备肺腺癌辅助诊疗制剂，具有重要的临床应用价值。
【IPC分类】C12Q1-68, G01N33-68, G01N33-577, G01N33-574
【公开号】CN104651522
【申请号】CN201510100547
【发明人】田子强, 王贵英, 温士旺
【申请人】河北医科大学第四医院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月6日