Inha基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数 排卵分子标记的应用及检测方法。
【背景技术】
[0002] 自20世纪20年代，Smith和Engle首次发现超数排卵现象以来，超数排卵技术应 用于不同哺乳动物，并发挥重要作用。利用超排技术，可以充分发挥优良母畜的繁殖潜力， 为胚胎移植技术提供更多的胚胎，加快育种速度。另外，超数排卵技术还用于克隆、胚胎冷 冻、转基因动物生产中。湘西黄牛具有耐粗饲、抗病能力强、繁殖性能好、遗传性稳定等优 点，是湖南省优良的肉役兼用型地方黄牛品种。但是目前，湘西黄牛的遗传资源的开发和利 用工作同国内其他黄牛品种相比相对滞后。DNA标记技术，不会受到环境、年龄、组织的限 制，是一种比较理想的遗传标记，受到了遗传育种工作者的重视。
[0003] 现有的用于超数排卵的黄牛，基本上是按照牛的表型，如发情的情况、体重、体质 健康、有无疾病等来选取，而且需要个体长到性成熟后才可以获得相应的超排数据信息才 能去评估该个体是否具有超数排卵优势。超数排卵是一种重要的数量性状，由多个基因控 制，因此，从遗传特性之一的DNA分子标记着眼，找到使湘西黄牛高效超数排卵的相关分子 标记，辅助湘西黄牛育种，具有重要的现实意义。
[0004] 抑制素（inhibin，INH)是一种糖蛋白类激素，主要来源于动物性腺中，由A、B两个 亚单位构成的异二聚体蛋白，其主要生理功能是在下丘脑-垂体-性腺轴中起重要的调控 作用，反馈性的抑制垂体促卵泡激素（follicle-stimulatinghormone,FSH)的释放，调控 动物的生殖活动。研宄表明INH是动物卵巢卵泡发育过程中的一种主要反馈调控因素，牛 在发情周期中FSH、INH二者呈负相关关系。INH的a亚基（INHA)是INH发挥生物活性的 重要组成部分。但未见其用作超数排卵的报道。
[0005]SNP是一种碱基替换型DNA标记，SNP作为遗传标记具有以下优势：①SNP分布广 泛、数量多，基因的编码区和非编码区都可能存在大量的SNP。②SNP适于快速、规模化检 测，在基因组筛选中SNP只需有无的分析，而不用分析片段的长度。③由于只存在一对等位 基因，SNP等位基因频率容易估计，易于基因分型。
[0006] SSCP作为SNP的检测方法之一，它的基本原理是：单链DNA片段呈复杂的空间折 叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个 碱基发生改变时，使其空间构象发生改变。空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺 凝胶中受排阻大小不同，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)，可以非常敏锐地将构象 上有差异的分子分离开。SSCP的优越性在于不需要测序就可以快速检出碱基突变。将SSCP 用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方 法的简便性和灵敏性。
[0007] PCR-RELP技术的基本原理是：先用PCR扩增出目的DNA片段，当DNA片段上有碱 基突变时，仅一个碱基的变异就会阻止限制酶在那个区域的作用，因此在突变和不突变的 个体间会产生长度的多态性；再用特异性内切酶酶切，当有碱基突变时，该DNA片段被切割 成不同大小片段，酶切产物可直接在凝胶电泳上分辨；不同等位基因的限制性酶切位点分 布不同，产生不同长度的DNA片段条带。
[0008] 利用PCR-RFLP技术也可挑选出与超数排卵性状相关的SNP位点。但是，RFLP分 析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限 制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用 受到了一定的限制。
【发明内容】
[0009] 有鉴于此，本发明提供INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记 的应用及检测方法。本发明提供INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标 记的应用。还提供了一种有利于准确选择出有超数排卵优势的湘西黄牛的方法，即利用 PCR-SSCP技术，为湘西黄牛的超数排卵提供一种分子标记，以此分子标记作为辅助选择超 数排卵湘西黄牛的方法。
[0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0011] 本发明公开了INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵的分子标记的应 用。
[0012] 所述INHA基因的Genbank登录号为：281254。
[0013] 在本发明的一些具体实施案例中，所述INHA基因含有多态性位点，所述多态性位 点为INHA基因自5'端第264位，所述多态性位点具有A/G碱基的变异。
[0014] INHA基因全长为3046bp，基因序列如下所不：
[0015]
[0016]
【主权项】
1. INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵的分子标记的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述INHA基因含有多态性位点，所述多态 性位点为INHA基因自5'端第264位，所述多态性位点具有A/G碱基的变异。
3. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述INHA基因自5'端第264位的碱基为 A/G的杂合体。
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，INHA基因的单链核苷酸序列自5'端第 264位的碱基为G，所述INHA基因的单链核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述动物为湘西黄牛。
6. -种鉴定或辅助鉴定动物超数排卵的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤1 :获得动物基因组DNA ; 步骤2 :扩增INHA基因片段，对扩增产物进行检测，根据所述INHA基因片段的单链核 苷酸自INHA基因5'端第264位的碱基判断所述动物是否超数排卵。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测为SSCP分型，当所述INHA基因 片段的单链核苷酸自INHA基因5'端第264位的碱基为G，所述SSCP分型电泳图具有四条 带时，所述动物超数排卵。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述检测为基因型测序，当所述INHA基因 片段的自INHA基因5'端第264位碱基为A/G的杂合体时，所述动物超数排卵。
9. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述INHA基因片段的序列如SEQ ID No. 2 所示。
10. 根据权利要求6至9任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的引物组包括上游 弓丨物和下游引物；所述上游引物的序列如SEQ ID No. 3所示；所述下游引物的序列如SEQ ID No. 4所示； 所述扩增的扩增体系为 10XPCR Buffer 2. 5 μ L ;ddH20 18. 3 μ L ;dNTP2. 0 μ L ;模板 I. 〇 μ L ;所述上游引物和所述下游引物各0· 5 μ L ;rTaq酶0· 2 μ L ;总体积25. 0 μ L ; 所述扩增的反应条件为： 预变性：95°C，5min ; 35 个循环：94°C，30s ;57°C，30s ;72°C，30s ; 延伸：72°C，lOmin。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，具体涉及INHA基因的单链核苷酸序列作为动物超数排卵分子标记的应用及检测方法。该湘西黄牛INHA基因存在Reference SNP Cluster Report：rs41257116位点，当该位点杂合为“A/G”时，表现出超数排卵的优势。用PCR-SSCP技术检测待测湘西黄牛INHA基因Reference SNP Cluster Report：rs41257116位点的部分片段，确定待测湘西黄牛INHA基因为AA或AG型，选取以INHA基因为AG型的湘西黄牛，作为可获得较好的超数排卵性状的湘西黄牛。本方法可提高湘西黄牛超数排卵的效率。本发明所用的方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，实施方便。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104651523
【申请号】CN201510102365
【发明人】陈树雄, 李纯锦, 陈璐, 李万宏, 刘卓, 孙丽娜, 赵云, 李洪蛟, 于佳鑫, 周虚
【申请人】吉林大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月9日