一种用于毛蚶家系鉴定的多重pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水产动物家系鉴定方法，特别是涉及了一种采用多重PCR进行毛 蚶家系鉴定的方法。
【背景技术】
[0002] 家系鉴定又称为系谱分析，是对个体间亲缘关系的一种判断分析。了解一个群体 的系谱特征，不仅在群体遗传学，保护遗传学，生态学等领域内具有重要的理论意义，而且 在良种培育、种质资源保护、人工放流苗种标记等领域具有重要的应用价值。
[0003] 微卫星标记是一种共显性的分子标记，具有变异程度高，在基因组中分布广泛，符 合孟德尔遗传，易于PCR扩增等特点，是家系鉴定中最常使用的分子标记。利用微卫星标记 进行家系鉴定，传统的分析方法是对每个标记的PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳分析，利用银染的方式对电泳结果进行显色，进而获得所需要的目的条带。这种方法一方 面存在处理通量低的问题，不适合于大量样本的分析，另一方面，基于聚丙烯酰胺凝胶电泳 的微卫星基因型分型的精度，也满足不了家系鉴定对基因型分型的精确要求，尤其在样本 量较大的情况下，为避免随机误差造成的影响，对分析方法的要求也更为严格。目前，利用 多重PCR的方式，使用荧光标记引物，结合毛细管电泳技术，提高处理通量和分型精度，实 现数据的自动判读，是目前微卫星标记应用的一个主流趋势。
[0004] 相比于凝胶电泳，毛细管电泳使用液态基质，具有速度快，精读高，可实现自动上 样的技术优点。毛细管电泳采用荧光标记的方式对位点进行区分，不同的荧光染料在被激 光激发后，会释放出不同波长的荧光信号，利用虚拟滤镜技术，可使得不同荧光获得区分。 这样，在同一根毛细管中可以同时混合多个位点，大大增加了处理通量。
[0005] 多重PCR技术是通过一个PCR反应同时扩增两个或者两个以上标记位点的技 术手段。相比于普通PCR，多重PCR的技术优势显而易见，不仅可以提高检测的速度和通 量，而且能够有效节约时间和成本。在水产动物的常见经济种类中，如海鲈 japonicus、，欠菱齊QScophthalmusmaximus)，嚴存、JL見驗QIetalurusPunetaus)等，均版 功的开发出了多重PCR反应试剂盒，并在生产实践中获得了应用。
[0006] 作为我国黄勸海的习见种，毛紺sMcreaate)长期以来都是北方沿海 重要经济种类。近年来，由于资源过渡开发和利用，我国毛蚶的自然资源面临着巨大的压 力，毛蚶目前已经被列为黄渤海人工增殖放流的品种之一，相关的良种培育工作也已经开 始实施。基于上述情况，获得足够数目，满足育种及放流标记实际要求的毛蚶微卫星多重 PCR体系具有现实紧迫性。
【发明内容】
[0007] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种高通量、准确率高的采用加尾引物进行 毛蚶家系鉴定的多重PCR方法，可快速、准确的对未知亲缘关系的毛蚶亲本与子代间进行 豕系鉴定。
[0008] 本发明具体的技术方案如下： 一种用于毛蚶家系鉴定的多重PCR方法，其特征在于包括如下步骤：提取亲本和子代DNA，按照下表中的序列合成正向引物，反向引物或反向加尾引物，以及带荧光标记的M13 (-21)通用引物；
【主权项】
1. 一种用于毛蚶家系鉴定的多重PCR方法，其特征在于包括如下步骤：提取亲本和 子代DNA ;按照下表中的序列合成正向引物，反向引物或反向加尾引物，以及带荧光标记的 M13(-21)通用引物；
使用合成的引物对及带荧光标记的M13(-21)通用引物，对提取的DNA样本进行多重 PCR扩增；对扩增产物的荧光信号进行检测，获得亲本和子代基因型数据；对亲本和子代进 行亲缘关系鉴定。
2. 根据权利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述正向引物的5'端添加 M13 (-21)通用引物序列。
3. 根据权利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述反向加尾引物的5'端添加序 列 GAGCGGATAACAATTTC。
4. 根据权利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述荧光标记为FAM，VIC，NED， PET中的一种；荧光标记被添加在单独合成的M13 (-21)通用引物序列的5'端。
5. 根据权利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述多重PCR扩增按照下表所述 的体系和条件进行，
每组多重PCR反应体系中，均加入带有一种荧光标记的M13 (-21)序列0. 15 μ Μ。
6. 根据权利要求1或5所述的多重PCR方法，其特征在于所述多重PCR扩增的反应程 序分为两步，前35个循环使用54°C的退火温度，后8个循环使用53°C的退火温度。
7. 根据权利要求1所述的多重PCR方法，其特征在于所述对亲本和子代进行亲缘关系 鉴定的方法是对扩增产物进行毛细管荧光电泳，并对扩增产物的荧光信号进行检测，通过 软件对亲缘关系进行分析。
8. 根据权利要求7所述的多重PCR方法，其特征在于所述的软件为Genemapper和 Cervus0
【专利摘要】本发明公开了一种用于毛蚶家系鉴定的多重PCR方法，该方法包括如下步骤：提取亲本和子代DNA；使用11个微卫星位点及带荧光标记的M13（-21）通用引物，对提取的DNA样本进行多重PCR扩增；对扩增产物的荧光信号进行检测，获得亲本和子代基因型数据；对亲本和子代进行亲缘关系鉴定。本发明的方法适用于进行大范围增殖放流群体亲本与子代间遗传关系的确认，以及大规模的人工良种培育实验，具有快速、准确、高通量的特点。通过微卫星标记鉴定所获得的谱系记录，不仅可以为毛蚶的良种培育提供有利的辅助育种手段，而且可以为评估增殖放流效果提供有力的技术支持。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104651525
【申请号】CN201510113198
【发明人】李琪, 陈辰, 于红
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月15日