一种植物组成型过量表达载体、分枝且高产油菜的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种植物组成型过量表达载体、分枝且高产 油菜的制备方法。
【背景技术】
[0002] 油菜（BrassicanapusL.)不但是世界上仅次于大豆的第二大食用油脂植物而 且同时也是植物油和植物蛋白的主要来源之一，占我国油料作物总产量的40%~45%。 油菜不是一个单一的物种，它包括芸薹属中许多种，根据我国栽培的油菜植物形态特征， 遗传亲缘关系，结合农艺性状，栽培利用特点等可分为三大类型：即白菜型油菜（Brassica campestris)、芥菜型油菜（Brassicajuncea)和甘蓝型油菜（BrassicanapusL.)。甘 蓝型油菜（BrassicanapusL.，AACC2n= 38)是由芸薹（AA2n= 20)和甘蓝（Brassica 01ercea，CC2n= 18)通过自然种间杂交后自然加倍进化而来的一个复合种。
[0003] DHHC(Asp-His-His-Cys)型锌指结构域是一种富含半胱氨酸高度保守的锌指结构 域，常出现在DNA结合蛋白中的一种结构基元。属于类C2H2型锌指，其序列特征为：C-X2-C-x9-hc-x 2-c-x4-dhhc-x5-c-x4-n-x3-f(c代表半胱氨酸；H代表组氨酸；X代表任意氨基酸）。
[0004] 目前，对DHHC型锌指结构域的研宄主要集中在酵母和哺乳动物，植物中的DHHC型 锌指蛋白研宄相对较少。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种植物组成型过量表达载体、转基因油菜的制备方法， 旨在通过所获得的植物组成型过量表达载体构建一种分支数和产量都增加的油菜新品种。
[0006] 本发明是这样实现的，一种植物组成型过量表达载体，该表达载体由35S启动子 驱动OsDHHCl基因和⑶S基因形成的融合基因，即35S::0sDHHCl-GUS;其中，所述OsDHHCl 基因是水稻中编码DHHC型锌指蛋白的0s02g0819100基因的另外一种剪接方式，其碱基序 列如SEQIDN0 :1所示。
[0007] 本发明进一步提供了上述植物组成型过量表达载体的构建方法，包括以下步骤：
[0008] (1)以水稻CDNA为模板，通过引物进行PCR扩增；其中，所述引物为：
[0009]OsDHHCl基因引物-F :
[0010]5 ' -CATGCATGCCATGGTGCTGGCACATATATCTCTTATGTC-3 '，
[0011]OsDHHCl基因引物-R:
[0012] 5' -GGAAGATCTGGAAGATCTGTTGTTTGTGATCTGGAACTCAGTG-3' ；
[0013] (2)将步骤（1)中的PCR扩增产物克隆到pUCm-T载体中，经测序鉴定后，用Ncol 和Bglll双酶切pUCm-T载体和pCAMBIA1301载体，分别回收小片段和大片段，然后进行连 接；
[0014] (3)将步骤⑵得到的连接产物转化大肠杆菌DH5a，经抗生素筛选获得阳性克 隆；提取阳性克隆的质粒，得到植物组成型过量表达载体。
[0015]优选地，在步骤（3)中，所述转化的方法是农杆菌介导的遗传转化方法。
[0016] 优选地，在步骤（3)中，所述转化的方法为将所述植物组成型过量表达载体电击 转化农杆菌GV3101，经100yg/ml利福平和50yg/ml卡那霉素筛选获得阳性克隆，再进行 农杆菌介导的遗传转化。
[0017] 本发明进一步提供了一种分枝且高产油菜的制备方法，包括以下步骤：
[0018] (1)通过上述植物组成型过量表达载体转化甘蓝型油菜植株；
[0019] (2)通过抗性筛选和RT-PCR鉴定得到获得分枝且高产油菜。
[0020] 优选地，在步骤（1)中，所述转化采用农杆菌介导的转基因方法。
[0021] 优选地，所述步骤（2)具体包括：
[0022] 对T1代幼苗进行潮霉素抗性筛选，获得的抗性幼苗实行单株收种；
[0023] 对T2代幼苗继续进行潮霉素抗性筛选，获得纯合子转基因株系；
[0024] 采用RT-PCR方法对获得的纯合子转基因株系进行鉴定，获得目的基因OsDHHCl表 达量明显增加的转基因纯合子株系。
[0025] 为克服现有技术的缺点和不足，本发明提供了一种植物组成型过量表达载体、分 枝且高产油菜的制备方法，利用水稻的DHHC型锌指蛋白基因OsDHHCl，构建该基因的植物 组成型表达载体，并将其转化甘蓝型油菜，通过抗性筛选，RT-PCR鉴定等获得分支数增加的 转基因植株。分析发现，转基因植株的产量比野生型明显增加，即本发明通过遗传转化培育 出了一个多分枝且高产的油菜新品种。
【附图说明】
[0026] 图1是本发明Ti类质粒pCAMBIA1301载体的T-DNA表达框的结构示意图；
[0027] 图2是本发明含OsDHHCl基因的Ti类质粒pCAMBIA1301载体的T-DNA表达框的 结构示意图；其中，35S:CaMV35S启动子；OsDHHCl:水稻中编码DHHC型锌指蛋白的基因； hygR:潮霉素抗性标记基因；⑶S: 0 -葡萄糖苷酸酶基因；LB和RB:分别为T-DNA的左边界 和右边界；MCS:多克隆位点；Ncol和Bglll:将OsDHHCl基因构建在pCAMBIA1301载体上所 用的酶切位点；
[0028] 图3是本发明中分枝且高产油菜与野生型油菜的形态对比图；A其中，WT为野生 型，335S::0sDHHCl-GUS-l、35S::0sDHHCl-GUS-2 和 35S::0sDHHCl-GUS-3 为转基因油菜 的三个不同株系；
[0029] 图4是本发明中分枝且高产油菜和野生型的分支数比较图；其中，WT为野生型， 335S: :0sDHHCl-GUS-l、35S: :0sDHHCl-GUS-2 和 35S: :0sDHHCl-GUS-3 为转基因油菜； PCAMBIA1301为pCAMBIA1301空载的转基因植株；
[0030] 图5是本发明中分枝且高产油菜与野生型油菜的⑶S组织化学定位检测结果图； 其中，WT为野生型；335S::0sDHHCl-GUS为分枝且高产油菜；
[0031] 图6是本发明中分枝且高产油菜中Hyg基因的检测结果图；Hyg基因是潮霉素筛 选标记基因；
[0032] 图7是本发明中分枝且高产油菜的半定量RT-PCR鉴定结果图；
[0033] 图8是本发明中分枝且高产油菜的OsDHHCl-GUS基因的检测；
[0034] 图9是本发明分枝且高产油菜和野生型的产量比较图；其中，WT为野生型， 35S::0sDHHCl-GUS-l、35S: ::0sDHHCl-GUS-2 和 35S::0sDHHCl-GUS-3 为转基因油菜； PCAMBIA1301为pCAMBIA1301空载的转基因植株。
【具体实施方式】
[0035] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0036] 实施例1分枝且高产油菜的制备
[0037] 1、OsDHHCl基因克隆和35S::0sDHHCl-GUS表达载体的构建
[0038] 水稻DHHC型锌指蛋白基因OsDHHCl为发明人新克隆的基因，是NCBI中 0s02g819100的另外一种剪接方式，其碱基序列如SEQIDN0:1所示。采用primer5软件 设计PCR引物，引物如下所示：
[0039]OsDHHCl基因引物-F:
[0040]5' -CATGCATGCCATGGTGCTGGCACATATATCTCTTATGTC-3 '，
[0041]OsDHHCl基因引物-R :
[0042] 5' -GGAAGATCTGGAAGATCTGTTGTTTGTGATCTGGAACTCAGTG-3?,
[0043] 上述两个引物划线部分为引入的Ncol和Bglll酶切位点。以油菜的cDNA为模板， 利用上述引物，进行PCR扩增。得到的PCR产物首先克隆到pUCm-T载体（购于上海生共生 物工程有限公司）中，经测序鉴定后，用Ncol和Bglll双酶切pUCm-T载体和pCAMBIA1301 载体（图1)，分别回收小片段和大片段，然后进行连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a， 经抗生素（50yg/ml卡那霉素）筛选获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，得到35S:: OsDHHCl-GUS表达载体（图2)。
[0044] 2、油菜的转化
[0045] 根据BI0-RAD电击转化仪说明书将35S::0sDHHCl-GUS表达载体电击转化农杆菌 GV3101，经抗生素（100yg/ml利福平和50yg/ml卡那霉素）筛选获得阳性克隆。挑取阳性 的单克隆置20mlLB液体培养基中（含100yg/ml利福平和50yg/ml卡那霉素），28°C震 荡培养24小时。将菌液按1 : 100的比例稀释，取200y1稀释菌液涂布新鲜的含抗生素 的YEB固体平板，28°C培养2~3天，用150mL的转化液（含5%蔗糖、0. 05%Silwet-77、 0. 4%乙酰丁香酮、0. 002%。6-BA的1/2MS液体培养基，PH5. 8)将培养皿中的农杆菌洗脱下 来，配置成0D600 ~ 0. 8的农杆菌转化菌液。将转化菌液装入塑料袋中，然后将去掉果荚 和已开放花朵的油菜花序抓成一束，轻轻伸入塑料袋，让转化菌液充分浸泡花序，时间为30 秒。浸泡后的花序立即用羊皮纸袋包扎。2~3天后按上述方法重复转化一次，同一花序共 浸泡转化3次。在完成最后一次转化的7天后，摘除花序上的羊皮纸袋。待种子成熟后，收 获晒干，得到T0代转基因种子。
[0046] 3、分枝且高产油菜植株的筛选
[0047] 将分枝且高产油菜种子播种在土壤中，在幼苗期按1 : 200(V/V)喷施潮霉素，每 隔2~3天喷施一次，连续喷4~5次。当抗潮霉素的油菜的主枝和部分侧枝现蕾并有几 朵小花开放时，用羊皮纸袋包扎，以避免杂交。种子成熟后，对其进行单株收种，得到T1代 种子，晒干后保存于_20°C备用。对T2代幼苗继续用潮霉素筛选，不再发生抗性分离的株系 为纯合子转基因株系。将本发明实施例得到的转基因油菜与野生型油菜的形态对比，如图3 所示。选取三个不同分枝且高产油菜株系335S: :0sDHHCl-GUS-l、35S: :0sDHHCl-GUS-2 和35S: :0sDHHCl-GUS-3,将以上三个不同