一种利用抗冻蛋白基因转化培育耐寒玉米的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于转基因植物的培育技术领域，具体涉及一种利用抗冻蛋白基因转化培 育耐寒玉米的方法。
【背景技术】
[0002] 自然环境下，低温寒害不仅影响植物生长发育也影响其地理分布；对于农作物而 言，低温寒害可能会使其减产和品质下降，严重时甚至绝收，是农作物生长发育过程不可避 免的非生物胁迫因素。我国东北部发生的早霜冻严重影响玉米的产量、云贵川频繁发生的 秋寒及倒春寒显著延缓玉米的生长发育从而造成减产。尤其是春播玉米，气温降至8°c连续 3-4天即可造成烂种和死苗，持续5-6天死苗率超过30-40%，持续一周死苗率超过60%。
[0003] 因此提高农作物的耐寒能力对于农业生产是十分必要的。通过品种改良提高农作 物的耐寒能力，是克服低温寒害最为经济有效地方法。然而，植物抗冻性属于多基因控制的 性状，其理化机制及遗传机理复杂，利用常规育种手段往往难以达到定向改良的目的。应用 分子生物学技术进行植物抗冻耐寒性的遗传改良逐渐成为了研宄热点并取得了一些成功。 因此，利用抗寒能力强、适宜农作物生理代谢机制与生产要求的抗寒基因来培育耐寒农作 物品种具有重要的研宄意义。
[0004] 20世纪60年代，科学家在生活在极区海域的鱼类血液中发现大分子物质，经研宄 命名为抗冻蛋白。此类物质在鱼类体内使得体液的冰点降到海水温度以下，保证血液不结 冰凝固。后来深入的研宄使得人们从极区鱼类、昆虫转到植物材料方向，全面的了解抗冻蛋 白的结构、功能和作用机理等方面。1991年，Hightower等人将抗冻蛋白基因afa3及融合 基因spa-afa5转入了烟草和番茄并成功获得转基因烟草和番茄，证明其编码的抗冻蛋白 有助于提高植物抵御低温寒害的能力。1999年，Michae等人从桃树中分离定位得到了具 有修饰冰晶能力抗冻蛋白，这也是首次发现的具有脱水素蛋白特性的抗冻蛋白。2000年， Sidebottom等在越冬植物黑麦草（Loliumperenne)中发现了热稳定性的抗冻蛋白AFP， 其抗冻效果不如已经发现的鱼类和昆虫类，但抑制冰晶重结晶的效果非常明显，因此有效 地保护植株组织免受冰冻伤害。2002年，Huang等人从冬季欧白英中克隆得到了热滞蛋白 STHP-64的全长。研宄发现热滞蛋白STHP-64的热滞活性很低，但加入柠檬酸后其热滞活 性明显提高，抗冻能力增强。2014年，Kumar等人将胡萝卜编码抗冻蛋白的基因用CaMV35S 启动子（cauliflowermosaicvirus35Spromoter)通过农杆菌介导法转化番前，成功获 得在4°C能保持完整表型的抗冻转基因番茄。
[0005] 本发明从矮沙冬青中克隆得到高活性抗冻蛋白基因AnAFP，构建植物表达载体 pTU-AnAFP，通过农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织，经过培养、分化获得再生转基因植 株，进行PCR检测及耐寒性鉴定，最终获得了耐寒性性显著提高的转基因玉米。
【发明内容】
[0006] 本发明的主要目的在于针对玉米耐寒性的研宄现状，提供一种利用抗冻蛋白基 因转化培育耐寒玉米的新方法。
[0007] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0008] -种利用抗冻蛋白基因转化培育耐寒玉米的方法，包括以下步骤：
[0009] 1)以抗冻蛋白基因AnAFP为模板，在引物AF和AR为引物前面加上Bam HI和Sma I的酶切位点进行PCR扩增；
[0010] 2)在30°C温育6~8小时条件下，将PCR产物与植物表达载体分别进行双酶切， 并回收和纯化；
[0011] 3)将双酶切回收纯化得到的目的片段和载体产物使用T4连接酶进行连接，置于 16°C水浴锅中连接过夜，构建重组质粒pTU-AnAFP;
[0012] 4)植物表达载体pTU-AnAFP转化农杆菌，并接种培养，待其0D为0. 5时，并侵染玉 米自交系的愈伤组织；
[0013] 5)将侵染的玉米自交系的愈伤组织接种至共培培养基，22°C暗培养3d;
[0014] 6)共培养的愈伤组织接种至恢复培养基上25°C暗培养7d;
[0015] 7)恢复培养后的愈伤组织转接到含1. 5mg/L除草剂草丁膦的筛选培养基上，20d 后将抗性愈伤组织转接到新鲜的选择培养基上，连续筛选3代，除草剂浓度按1. 5mg/L、 2. 5mg/L、3. 5mg/L递增；
[0016] 8)选取抗性愈伤组织，转接到分化培养基上分化幼苗，将分化出的幼苗转接到生 根壮苗培养基上培养，得到L转基因再生植株。
[0017] 利用矮沙冬青抗冻蛋白基因AnAFP，以AF和AR为引物进行PCR扩增，构建植物 表达载体pTU-AnAFP，将植物表达载体pTU-AnAFP利用农杆菌介导法转入优良玉米自交系 18-599红的胚性愈伤组织，通过除草剂筛选、分化、生根壮苗培养，即可获得再生转基因植 株。
[0018] 本发明所述的上游引物AF为W -ATGGCAGGTATCATCAACAAGAIT-3\T游引物AR 为A'-CTAGTCACTGTCACTGCTGCTGCT-3'。
[0019] 步骤（1)中PCR扩增体系为每20yL中含有：10XPCR缓冲液2. 0yL，DNA1yL， dNTPs1.6yL，上游引物AF4yL，下游引物AR4yL，TaqDNA聚合酶2yL，ddH20加至终体 积 20yL;PCR反应程序为：先 94°C3min;再 94°C10s，58°C30s，72°C50s，循环 34 次；72°C 延伸8min，12°C保存。
[0020] 步骤⑵中PCR产物酶切体系为：10 XT缓冲液1 yL，BSA 2 yL，PCR产物彡1 yg， BamHI1 yL，SmaI1 yL，ddH20加至终体积20 yL;植物表达载体酶切体系为：10 XT 缓冲液1UL，BSA 2yL，表达载体彡1yg，BamHI1yL，SmaI1yL，ddH20加至终体积 20 yL〇
[0021] 步骤（3)中T4连接酶反应体系如下：10XT4DNAligaseBuffer2. 5yL，目的片 段DNA0.3pmol，pTF101.1-Ubi-T-nos0.03pmol，T4DNAligaselyL，ddH20 加至 25yL〇
[0022] 步骤（4)具体为将含有目的基因的植物载体pTU-AnAFP的农杆菌接种到含50mg/ L利福平和50mg/L壮观霉素的YEP培养基中，在28°C培养2天，挑取单个菌落于含相应抗 生素的lmLYEP培养基中，28°C、180r/min振荡培养12h，再将其加入含相应抗生素的50mL YEP培养基（牛肉膏5g/L+蛋白胨5g/L+酵母提取物10g/L+蔗糖5g/L+MgS04. 7H20 0? 5g/ L，pH7. 2)扩大培养至006(|(|为0. 5 ;4°C、4000r/min离心lOmin收集菌体，用等体积的液体 浸染液（N6+2, 4-D1. 5mg/L+L-脯氨酸0? 69g/L+鹿糖68. 4g/L+葡萄糖36g/L)悬浮；将待转 化优良玉米自交系的愈伤组织浸入含乙酰丁香酮（AS)的浸染培养液，黑暗浸染lOmin。
[0023] 步骤（5)所述的共培培养基为：N6基本培养基+L-脯氨酸0. 69g/L+乙酰丁香酮 20mg/L+ 硝酸银 0? 85mg/L+L_ 半胱氨酸 300mg/L。
[0024] 步骤（6)所述的恢复培养基为：继代培养基+MES0. 5g/L+噻孢霉素250mg/L+硝 酸银 0? 85mg/L。
[0025] 步骤（7)所述的筛选培养基为：继代培养基+MES0. 5g/L+噻孢霉素250mg/L+硝 酸银0? 85mg/L+除草剂。
[0026] 步骤（8)所述的分化培养基为：MS+KTlmg/L+肌醇120mg/L+水解酪蛋白lOOmg/ L+L-脯氨酸690mg/L+噻孢霉素250mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5~6g/L;所述的生根壮苗培 养基为1/2MS+ABTlmg/L+水解酪蛋白30mg/L+肌醇50mg/L+蔗糖15g/L+琼脂5~6g/L。
[0027] 经过自交繁育、分子检测等研宄，表明该株系是含有矮沙冬青抗冻基因AnAFP的 转基因植株。
[0028] 本发明的有益效果为：本发明方法利用农杆菌介导法技术，可培育出具有优良耐 寒玉米转基因植株，从根本上解决玉米寒害问题，显著提高玉米产量，提高其经济价值。
【附图说明】
[0029] 图1是PCR扩增目的基因电泳检测结果图；
[0030] 图2是重组表达载体pTU-AnAFP双酶切验证电泳检测结果图；
[0031] 图3是植物表达载体pTU-AnAFP;
[0032] 图4是I；再生植株目的基因PCR检测电泳结果图；
[0033] 图5是1\代植株目的基因PCR检测电泳结果图；
[0034] 图6是1\代阳性植株低温胁迫后表型鉴定图；
[0035] 图7是AnAFP目的基因熔解曲线分析图；
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