漾濞大泡核桃病程相关蛋白10基因JsPR10-1的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学W及基因工程相关研究领域，特别是具有抗真菌活性的濛 潰大泡核桃病程相关蛋白10基因/5化7^?-2的应用。
【背景技术】
[0002] 21世纪，人类面临耕地减少、人口增加和人民生活水平不断提高=个不可逆转的 局面。提高农作物单产是21世纪农业的重要措施，但植物病害严重影响农作物的产量和质 量，其中，真菌病害是最重要的一类植物病害。传统控制植物病害的方法主要是选育抗病品 种和使用化学农药，虽然取得了一些效果，但常规育种周期较长，投入的人力、物力较大，防 治效果不稳定，使用农药对人畜、环境等的安全问题等缺陷，因而两者均不能从根本上解决 植物病害的难题。随着分子生物学和生物技术的快速发展，利用分子生物学技术获得具有 抗真菌活性的基因，并通过转基因技术培育抗病品种，是提高植物抗病能力的新方法。
[0003] 植物病程相关蛋白（pathogenesis-relatedprotein,PR)是植物在受到细菌、真 菌和病毒等病原体入侵或受到非生物胁迫时产生并积累的一类蛋白质的总称，是植物参与 防御反应的重要组成部分。PR蛋白最早是vanLoon等于1970年在烟草花叶病毒侵染的烟 草叶片中发现的（VanLoon,L.C. ,Pierpoint,W.S. ,Boiler,T.比，&Conejero, V. 1994.Recommendationsfornamingplantpathogenesis-relatedproteins.Plant MolecularBiologyR巧orter, 12: 245 - 264. )。PR蛋白在不同植物中表现为几了质酶、 葡聚糖巧酶、蛋白酶抑制剂、过氧化物酶和类核糖核酸酶等。根据其结构、亲源关系和生物 活性，PR蛋白主要分为 17个亚类；PR1 ~PR17 (VanLoon,L.C.，Rep,M.，fePieterse, C.M.J. 2006.Significanceofinducibledefense-relatedproteinsininfected plants.AnnuRev化}ftopathol, 44: 135 - 162.)，广泛存在于单子叶和双子叶植物中。其 中一类具有核酸酶活性的蛋白定义为第10类PR蛋白（简称PR10)，引起很多研究者的兴 趣。
[0004] 与大多数胞外ra蛋白不同，PR10是一类胞内蛋白。PR10蛋白具有与核酸酶相似的 结构，分子量为16~19kDa，等电点偏酸性，大部分特异定位在细胞质中，具有体外核酸酶活 性和抗菌活性。对PR10基因结构分析表明，PR10基因编码的氨基酸中都具有一个高度保守 的GXGGXG狂是任意氨基酸）序列模型，被称为叩-loop"结构域。叩-loop"是一类广泛存 在于磯酸化激酶和核酸结合蛋白中的结构域，并且其磯酸化可能与PR10的核糖核酸酶活 t生有关（Bantignies,B. ,Seguin,J. ,Muzac,I. ,Dedaldechamp,F. ,Gulick,P. ,& Ibrahim,R. 2000.DirectevidenceforribonucleolyticactivityofaPR-lO-like proteinfromwhitelupinroots.Plantmolecularbiology, 42: 871 - 881.)。
[0005]研究表明，多种外源激发因子（细菌、真菌、病毒等病原物）和内源激发因子（水 杨酸、己締、过氧化氨等）均能诱导巧?2如勺基因表达。与此同时，AW0也受多种非生物胁 迫的诱导，如盐、热、冷、紫外光等。Qiadha和Das研究发现花生心巧P-2逸j因受病原菌的 诱导，其融合蛋白在体外能显著地抑制巧wariuffl(9々^巧7〇??和化izoc細soyani的生 长（Qiadha,P.，&Das,R?比 2006.Apathogenesisrelatedprotein,AhPRlOfrom peanut:aninsightofitsmodeofantifungalactivity.Planta, 225: 213 - 222.)。 在水稻中，莱莉酸诱导做做化7。的表达上调（Hashimoto，M.，Kisseleva，L，Sawa， S.，Furukawa,T.，Komatsu,S.， &Koshiba,T. 2004.AnovelriceP民 10protein, 民SOsP民10,specificallyinducedinrootsbybioticandabioticstresses, possiblyviathejasmonicacidsignalingpathway.Plantandcellphysiology， 45: 550 - 559.)。Park等研究辣椒佛湛因时发现，其在高盐处理后30min开始积 累，6h后表达最强巧ark,C.J.，Kim,K.J.，Shin,R.，Park,J.M.，Shin,Y.C.， &Paek,K.H. 2004.Pathogenesis-relatedprotein10isolatedfromhotpepper functions过s过ribonucle过sein过n过ntivir过1pathway.ThePlantJourn过1， 37: 186 - 198.)。虽然很多PRIO蛋白都是在病原物侵染或者某些信号分子（如水杨酸、乙締等） 的诱导下生成和大量积累的，但也有一些研究表明，PR10在正常生长的植株中存在组成型 表达，如玉米的许巧口 许-/ft/，它们都在根中高水平表达，但许化各个组织的 表达量明显高于為(Xie，Y.R.，Qien，Z.Y.，Brown，R.L,feBhatnagar，D. 2010.Expressionandfunctionalcharacterizationoftwopathogenesis-related protein10genesfromZeamays.Journalofplantphysiology, 167: 121 - 130.)。 [000引 PRIO广泛应答生物胁迫，具有抗菌活性。来自高丽参（仿naX知贫C. A.Meyer)的戶妍盛因在拟南芥中异源表达，接种下香假单胞菌（化(憲 巧扣洗）、尖抱镶刀菌作（9巧呵70T歴）和灰霉病菌（抓cinarc苗4天后，统计转基 因和野生型植株感病叶片数，结果表明，与野生型植株相比，转基因拟南芥增强了对臥上 S种病原菌的抗性 <Xee, 0?R.，Kim,Y.J.，Balusamy,S.R.D.，Khorolragchaa, A.，Sathiyaraj,G.，Kim,M.K.， &Yang,D.C. 2012.Expressionoftheginseng PgP民l0-linArabidopsisconfersresistanceagainstfungalandbacterial infection.Gene, 506: 85 - 92.)。从感染黄曲霉（心风9_/讲77似* 的花生 如W解L.)中克隆得到心并转入花生中高效表达，心24片化7巧专基因 花生种子抗A如取(9解淵能力明显提高（Xie，C.，Wen，S.，Liu,比，Qien，X.，Li, 比，Hong,Y.， &Liang,X. 2013.OverexpressionofAMhPRlO,amemberofthe PRIOfamily,decreaseslevelsofAspergillusflavusinfectioninpeanutseeds. AmericanJournalofPlantSciences, 4: 602.)。枉Escherichiac<97iBL21 中表达 的棉花（份w巧如歴知r如沁打心併?化7。-/，体外抑菌实验显示，加PRlO-1蛋白可臥抑制 Verticilliumdahliae^^^^^(Chen,L.，Sun,N.，Wang,J.，Ling,H.，Zhang, L.， &Zuo,K. 2013.FunctionalanalysisofawiltfungusinducibleP民10-1gene fromcotton.AmericanJournalofPlantSciences, 4: 417.)。
[0007] 本发明中病程相关蛋白基因化7。-/来自潇濤大泡棱桃（/解知打si知77如a Dode)。潇濤大泡棱桃是云南主要的本地棱桃么一，具有果大、壳薄、仁厚、味香、含油率高等 优点，对由胶抱炭痘菌引起的病害具有较强的抗性。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供潇濤大泡棱桃病程相关蛋白10基因的新用途，即 在提高烟草对胶抱炭痘菌、核盘菌、葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌抗性中的应用。
[0009] 本发明从濛潰大泡核桃中克隆获得的具有抗真菌活性的病程相关蛋白10的全长 基因/5化7^?-2，/5化7^?-2的核巧酸序列如569ID^;1所示，该基因全长为776bp，包含 一个483bp的开放阅读框