突变核苷酸分子及包含其的转化植物细胞以及制备可恢复雄性不育转基因植物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种突变核巧酸分子及包含其的转化植物细胞W及制备可恢复雄性 不育转基因植物的方法，具体而言，设及包含转录因子bHLH142的核巧酸序列和插入的 T-DNA区段的突变核巧酸分子，W及包含所述突变核巧酸分子的新型转化植物细胞和雄性 不育突变体植物，还设及新型可恢复雄性不育转基因植物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 水稻的ryzasativa)是世界上最重要的主要作物之一，喂养着几乎一半的世界人 口，并且其充当单子叶植物的模型，单子叶植物包括许多重要的农作物（例如小麦、玉米、 高梁、粟）。粮农组织（FAO)预测水稻产量至2050年必须增长50-70%^满足需求。目前采 用数种方法来增加水稻产量，例如杂交优势育种、群体改良、远缘杂交、基因工程和分子育 种1。其中，据认为杂交水稻是最有前途的（产量增加15-20% )2。由F1代杂交种子产生的 作物在产量提高、农艺性状和最终使用品质的一致性方面给出了显著的益处。该归因于通 过组合经仔细选择的亲本系而产生的"杂种优势"。在过去数十年杂交作物是全球作为产量 的显著增加的原因，该进展中雄性不育（M巧起着重要作用。雄性不育性状可分为由线粒体 等细胞质因子决定的细胞质雄性不育（CM巧，和由细胞核基因决定的基因雄性不育佑M巧。 CMS已经长期用于杂交谷物制备，而目前CMS和GMS都用于杂交水稻制备3,该是由于通过操 纵任何所选择基因型中的基因-细胞质组合而控制不育性表达的方便性。最重要的是，其 规避了异花授粉品种中去雄的需要，从而促进在天然条件下杂交育种生产纯杂交种子。但 是，商业化的种子生产必须是简单廉价的，对于该S系杂交体系，为了生产CMS系的种子储 备而需要的保持系增加了生产成本。
[0003] 另一方面，由核基因控制的遗传（GMS)，提供了另一种杂交种子生产体系。对于双 系杂交体系，有益的是使用光周期诱导的或温度诱导的MS(PGMS或TGM巧突变体来保持用 于杂交种子生长的种子储备库。目前在中国PA64S是双系杂交水稻育种中使用最广泛的母 系，并且其与亲本系93-11杂交而产生了超级杂交稻LYP94。PA64S源自自发性PGMS梗稻突 变体NK58S(长日照->13. 5h)气也是TGMS釉稻，其MS受到大于23. 5°C的温度的促进，但是 在21~23°C之间的温度恢复其育性。最近的匹配分析证明了该些MS系中的P/TGMS受新 型小RNA调节5。在最近发现的另一种稻基因MS突变体（CarbonStarvedAnther(CSA))的 情况下，对R2R3MTO转录调节子进行的突变不能使花粉发育6,并且进一步的研究表明csa 是新型的光周期敏感性突变体，在短日照条件下显示MS但在长日照条件下显示雄性育性7。 其对日照长度的MS敏感性的分子基础仍待解决。
[0004] 使用大量转基因已经生产转基因雄性不育性，但是由于缺少有效经济的手段来控 制MS系，或缺乏合适的恢复子（restorer)，转基因雄性不育性在商业生产杂交种子方面的 应用受到限制8。最近，通过操纵R2R3MTO结构域蛋白（AtMYB103)而在转基因拟南芥植物 中证明了可恢复MS体系8。在AtMYB103启动子的控制下使用插入突变体或AtMYB103EAR 嵌合阻遏子构建体来阻断AtMYBlOS的功能，导致完全不结巧的MS8。将含有被更强的另一 特异性启动子驱动的AtMYBlOS的恢复子导入花粉供体植物中，并杂交到MS转基因植物中 用作阻遏子。F1植物的雄性育性得W恢复。嵌合阻遏子和恢复子构成了用于杂交种子生 产的可恢复MS体系。该体系在大规模杂交种子生产的成功应用取决于MS雌性亲本系是否 能够有效经济地繁殖。作为选择，通过化学或其他因素（例如光周期或温度）控制的诱导 型启动子可直接用于调节GMS基因（例如bHLH142)的表达，并且控制转基因植物的花粉发 育，消除了保持MS系的昂贵要求。
[0005] 水稻花药由通过结缔组织和维管组织附着至中央巧部的四个裂片组成。当完成花 药形态形成时，在中部形成小抱子母细胞，其由四个花药壁层围绕；外表皮层、内皮层、中间 层和绒拉层9。绒拉层位于花药壁的最内细胞层，并且在为花粉发育供应诸如脂质、多糖、 蛋白和其他营养物等营养物中起重要作用W。绒拉层在花粉发育末期经历程序化细胞死亡 (PCD) 11;该PCD引起绒拉层退化并且其特征在于细胞皱缩、线粒体和细胞骨架退化、细胞核 皱缩和染色体DNA的核小体内切割。绒拉层PCD必须在花粉发育的特定阶段出现W进行正 常的绒拉层功能和花粉发育，并且绒拉层PCD的早熟或延迟W及细胞退化可能引起雄性不 古3, 12-14目 。
[0006] 对拟南芥中的MS进行遗传和功能基因组研究已经显示，许多转录因子订巧 在花粉发育和绒拉层PCD的调节，如DYSFUNCTIONALTAPETUM1 0YT)、绒拉层发育和 功能UTapetalDevelopmentandRmction1，TDF1，AtMYB35)中的缺陷、ABORT邸 MICROSPORES(AMS,水稻中TDRl的同源物）和MALEST邸ILITYl(MSI)方面起关键作用；该 些因子中的突变都会产生MS表型。花粉发育的基因调节途径表明，DYT1，TDF1"和AMSle 在早期绒拉层发育起作用，而MS188"和MSIIS'19在晚期绒拉层发育和花粉壁形成起重要 作用。同时，在水稻中，已知数种TF，例如未发育的绒拉层1化ndevelopedTapetumLUDTl， DYTl的同源物）是知道的早期绒拉层发育的关键调节子w。此外，TAPETUMDEGERATION RETA畑ATION(TDRl)"、GAMYB2i'22、etERNALTAPETUM1(EAT1)23和delayedTAPETUM DEGE肥RATION值TD)24中的突变都引起与绒拉层PCD有关的MS。TDRl是拟南芥AMS基因的 直系同源物，在水稻中的绒拉层PCD中起关键作用；并且t化1显示延迟的绒拉层退化和核 DNA片段化W及从四分体释放后小抱子的吸收。分子证据指出TDR1直接结合CP1和C6的 启动子W用于他们的转录M。C6编码在脂质球状体发育和花药发育期间的花粉外壁方面起 关键作用的转运蛋白"。CP1设及生物体系中的细胞内蛋白变性，其突变体显示缺陷性的花 粉发育25。EAT1作用在TDR1的下游并且直接调节编码参与绒拉层PCD的天冬氨酸蛋白酶 的AP25和AP37的表达23。
[0007] 碱性螺旋-环-螺旋化HLH)蛋白是TF的超家族，并且是植物中最大的TF家族之 一。在水稻基因组中存在至少177个bHLH基因26'27,在拟南芥基因组中存在已经鉴定出多 于167个地LH基因28'29。通常，真核TF由至少两个离散的结构域组成，DNA结合结构域和 激活或阻遏结构域，它们一起用于调节祀基因转录起始的速率W。bHLHTF在植物细胞和组 织发育W及植物代谢中起许多不同的作用3。HLH结构域促进蛋白-蛋白相互作用，使得形 成同源二聚复合物或异源二聚复合物31。它们W二聚体的形式结合至特定的DNA祀位点， 并且在多种生物过程中是重要的调节组件29。迄今为止，已经显示bHLHTF中的S种参与 水稻花粉发育-UDT1化化化64)、TDR1化化册）和EAT1/DTD1 (bHLH141)。
[000引从对TNG67经T-DNA标记的水稻突变体库32进行筛选，我们分离了编码地LHTF的 另一成员化HLH142)的新型MS相关基因。在本发明中，解释了MS在该突变体中的分子机 审IJ，其表明bHLH142在花药中特异性表达，并且在花粉发育过程中在PCD所需的蛋白酶基因 的转录中bHLH142与TDR1协同调节EAT1启动子活性。也就是说，bHLH142通过控制绒拉 层PCD而在水稻花粉发育中起重要作用。空突变体和过表达转基因植物显示完全的雄性不 育性表型。最令人感兴趣的是，过表达植物在低温下恢复了育性。在其他主要的谷类作物 中发现具有高相似性的SEQIDNo.2的同源物，并且其使用可W通过操纵bHLH基因增加谷 类作物的生产率，W用于雄性不育性的开发和杂交作物的生产。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于开发一种突变核巧酸分子W及包含所述突变核巧酸分子的转 化植物细胞和雄性不育突变体植物，其中所述雄性不育突变体植物可用作母本生产F1代 杂交种子，由此改善作物产量和质量。
[0010] 本发明提供一种突变核巧酸分子，所述核巧酸分子包含转录因子bHLH142的核巧 酸序列和插入的T-DNA区段。优选的是，所述T-DNA区段插入转录因子bHLH142的核巧酸 序列的第S内含子中；更优选的是，所述T-DNA区段插入+1257bp处。
[OCm] 在突变核巧酸分子的一