Knickkopf基因dsRNA在害虫防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及飞幢knic化opf(Knk)基因dsRNA在害虫防治 中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前对于农业害虫的防治主要依靠化学杀虫剂的施用。长期施用农药产生一系列 问题，害虫对杀虫剂的抗药性增强，导致杀虫剂剂量的加大，农药大量残留加重对环境的污 染，最终危害人类的健康。因此，迫切需要开发环境友好型的生物杀虫剂。
[0003] RNA干扰（RNAi)是指双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)与同源mRNA特异 性结合而使其降解，从而导致基因沉默阻止基因的正常表达。RNAi技术于1998年在秀丽隐 杆线虫（Caenorh油ditiselegans)中报道，2006年获得诺贝尔奖。该技术兼具特异性和高 效性，是目前基因功能研究的重要手段，同时在作物害虫防治方面展示了广阔的应用前景。 采用RNAi技术进行害虫控制具有杀虫专一性高和无残留等特点，已被公认为"第四代杀虫 剂"，是植物保护领域未来的重要发展方向之一。因此筛选高效致死昆虫的特异性dsRNA分 子祀标对于加速RNAi技术在害虫防治中的应用具有重要的意义。
[0004] 昆虫表皮可W保护昆虫免受外界机械性损伤和病原微生物的侵害，对昆虫生长发 育起着重要的作用。Knk基因参与昆虫表皮几了质的有序排列，该基因的沉默将导致表皮几 了质排列素乱，丧失表皮的正常功能而导致昆虫晚皮阻滞而死亡。因此，本发明基于RNA干 扰技术，提供了一种对环境无毒无害、特异性强的新型害虫防治分子祀标。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种飞幢Knk基因和其合成的dsRNA，W及dsRNA在害虫防 治中的应用。
[0006] 本发明提供的一种飞幢Knk基因，该基因的核巧酸序列为SEQIDNO;1所示的序 列。核巧酸序列的获得是将从飞幢转录组数据库中捜索获得的片段通过GeneDoc软件拼接 比对后，进一步同时设计上游引物SEQIDN0;3和下游引物SEQIDN0;4,通过PCR扩增获 得，将纯化后的PCR产物与PEASY-bluntzero载体同时转入trans-Tl感受态细胞中培养， 挑取白斑后接入LB液体培养基中培养，后提取质粒。将检测含有目的条带的菌液后送入公 司测序，测序获得该基因的核巧酸长度为2074bp，其核巧酸序列为SEQIDN0;1。
[0007] 本发明提供的一种飞幢Knk基因编码的氨基酸，其特征是序列SEQIDNO;2所示 的序列。该氨基酸序列获得是采用Ex化Sy在线软件将SEQIDNO;1翻译为相应的氨基酸 并对其蛋白特性进行进一步预测。结果表明Knk基因的编码681个氨基酸，分子量为77KD， 理论等电点为5. 86。
[000引本发明提供的一种飞幢Knk基因片段及其合成的dsRNAW及在害虫防治中的应 用：基于飞幢Knk基因的核巧酸序列，采用引物设计软件primerpremierS.O分别设计一 条均含有T7启动子的上游引物SEQIDN0;5和下游引物SEQIDN0;6,经过PCR扩增获得 一段长度为538bp的DM片段，其序列为SEQIDNO;7所示（两端均含有T7启动子）。收 集经过试剂盒纯化后的PCR产物并将其作为dsRNA合成的模板，依照T7化boMAX?Express RNAiSystem(Promega)试剂盒体外转录合成dsRNA，然后使用微量进样器将其注射进入飞 幢体腔内。对其mRNA表达量进行检测，同时观察其表型。结果显示注射飞幢Knk基因片段 合成的dsRNA后，其表达量显著降低，同时飞幢出现晚皮困难最终死亡的表型。
[0009] 飞幢Knk基因片段合成的dsRNA对飞幢致死的原因研究；将注射dsGFP的虫体设 为对照组，同时将注射Knk基因片段合成的dsRNA(dsKnk)的飞幢设为处理组。分别将dsGFP 和dsKnk注射进入飞幢体腔内，将其表皮解剖下来进行固定，采用透射电镜方法揭示dsRNA 对飞幢的致死作用的原因。结果表明，与对照组相比，注射dsKnk的处理组虫体的表皮的几 了质致密排列的层状结构消失。
[0010] 本发明的有益效果；飞幢注射Knk基因片段合成的dsRNA后，出现晚皮困难并致死 的现象，具体表现为背部脊线开裂，背部弓起，但虫体难W从旧表晚出最终死亡。死亡率为 76%。本发明飞幢Knk基因片段合成的dsRNA对飞幢具有高的致死率，对于害虫防治具有 重要的现实意义，可W为害虫防治提供新的途径。
【附图说明】
[OCm] 图1 ;飞幢Knk基因全长cDM的PCR扩增检测图（M所示为化5000DNAMarker,从 下到上的条带依次为 100、250、500、750、1000、1500,2000、3000、5000bp，l所示为飞幢Knk 基因）
[001引 图2;SEQIDNO;7合成的dsRNA进入飞幢体腔内2化后，飞幢Knk基因的mRNA表 达图（1为注射dsGFP的对照组，2为注射dsRNA的处理组）。0 -actin为内参基因。其中 冲<0. 05, *冲<0. 01。
[001引图3;SEQIDNO;7合成的dsRNA对飞幢5龄若虫晚皮的影响（1为注射dsGFP的 对照组，2和3均为注射dsRNA的处理组）。实验组飞幢出现晚皮困难并死亡的表型。
[0014] 图4 ;dsRNA对表皮几了质超微结构影响。实验组飞幢几了质致密的层状结构消 失。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1 ;飞幢Knk基因全长cDNA获得W及氨基酸预测
[0016] 1.飞幢Knk基因片段捜索
[0017] 从飞幢的转录组数据库中进行化igene捜索，后采用NCBIBlastx在线软件进行 分析，确定获得1条飞幢Knk基因片段。
[0018] 2.飞幢Knk基因全长cDNA获得
[0019] 1)PCR扩增所需引物设计：
[0020] 采用GeneDoc软件对捜索获得的飞幢Knk基因片段进行拼接比对，并采用primer premiers. 0 软件分别设计上游引物AAGAAATGCACGAATTAGCAATATG(SEQIDN0;3)和下游引 物TTAACACTAATTTTGCATCACAGTCC(SEQIDN0;4)。将设计好的引物送往上海英潍捷基生物 有限公司合成。
[0021] 2)PCR扩增所需模板制备：
[0022] 选取大小一致、生长状况良好的飞幢5龄若虫，在体式显微镜下将其表皮快速剥 离，并迅速保存于液氮中。参照TaKaRaTrizol试剂盒提取RNA。采用M-MLV反转录酶将所 提RNA反转录成第一链cDNA。从而获得PCR反应所需模板。
[0023] 3)PCR扩增反应
[0024] PCR扩增获得飞幢Knk基因全长cDNA通过琼脂糖凝胶进行检测（图1)。扩增获 得的？〔1?产物通过661￡义化03(31：；[0]11(；[1：(01116肖3)纯化后与阳45￥-13111]11261'0(全式金公 司）载体同时转入