一种利用菇渣发酵产氢的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及一种利用菇渣发酵产氢的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]能源是人类社会赖以生存及发展的物质基础，其消耗水平成为衡量社会经济发展水平和文明发展的标志。随着工业水平和社会文明的迅速发展，世界对能源的需要日益剧增，能源短缺和环境污染已是人类社会进步所面临的巨大挑战。目前世界上所消耗的能源中绝大部分都来源于化石能源，但由于存储量有限、不可再生、污染环境等问题，严重制约了人类社会活动的开展，生物炼制应运而生，同时被人们寄予厚望，成为了能源研宄领域的热点。生物能源由于存在一定的与人争粮、与粮争地等问题后，严重制约了生物能源产业化的发展。目前我国的生物能源产业界已经清理、调整了生物能源的发展方向，即以现有非粮食木质纤维素进行生物能源的生产。将木质纤维素生物转化为能源时需要先将其糖化转化为微生物可利用的可发酵性糖，这一过程中存在底物预处理成本高、酶的成本高和转化率低等问题。
[0003]氢气作为能源具有热值高、燃烧后仅仅生成水、可再生性等已成为一种高效、清洁、可持续的理想新型能源，是最具发展潜力的新能源，除了作为能源还可以作为工业原料，在石油化工、食品加工、航空航天等方面具有广泛的应用。常规的制氢方法虽然技术成熟，但是不能解决目前所面临的资源、环境等问题，而生物质制氢可以解决上述问题，已经备受研宄者的青睐，各国也加大力度开发生物质氢。
[0004]原材料和酶的成本在生物燃料生产中占据较大比重，因此如何选择所使用的原材料和酶以降低生物燃料的成本是研宄人员的研宄方向。
【发明内容】
[0005]为了解决现有生物制氢的不足，本发明的首要目的在于提供一种利用菇渣发酵产氢的方法。该方法以葫澄为原料，利用嗜热厌氧梭菌(Clostridium thermocellum)进行厌氧发酵以达到制氢的目的。该过程中菇渣作为原料不进行复杂预处理，仅仅采用洗涤、粉碎等处理，很大程度上节约了成本，同时降低了酸碱预处理造成的环境污染问题，而且以农业废弃物为原料，在变废为宝的同时可以降低其对环境的污染的问题。该方法采用低成本的原料、不添加额外的纤维素酶，是一种高效、环境友好型的低成本生物制氢工艺。
[0006]本发明的另一目的在于提供所述利用菇渣发酵产氢的方法的应用。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种利用菇渣发酵产氢的方法，包括如下步骤:在发酵培养基中接种嗜热厌氧梭菌(Clostridium thermocellum)进行厌氧发酵，得到氢气。
[0008]所述的发酵培养基的组成为:A液、B液、C液、D液和E液按体积比40:2:1:1:1混合得到，pH值为7.0?7.4，优选为7.2 ;或A液、B液、C液、D液、E液和F液按体积比37:2:1:1:1:3混合得到，pH自然。
[0009]A液中含有20?60g/L的菇渣作为碳源，菇渣的浓度优选为40?60g/L ；B液中含有柠檬酸钾50g/L、一水柠檬酸31.25g/L、硫酸钠25g/L、磷酸二氢钾25g/L和碳酸氢钠62.5g/L ；C液中含有氯化铵75g/L、尿素250g/L和酵母抽提物50g/L ；D液中含有六水氯化镁50g/L、氯化亚铁四水合物5g/L、二水氯化1? 10g/L和L-半胱氨酸盐酸盐一水物50g/L ；E液中含有二盐酸吡哆胺lg/L、对氨基苯甲酸0.2g/L、D-生物素0.lg/L、维生素B120.lg/L和维生素B10.2g/L ；F液中含有尿素250g/L。A液、B液、C液、D液、E液和F液中的溶剂为去离子水。
[0010]所述的菇渣通过如下方法制备得到:将菇类生产后的废弃物直接烘干或用清水洗涤至中性后烘干至恒重，粉碎得到。菇类生产后的废弃物一般包括菇类的培养基以及被废弃的菇体。
[0011]所述的粉碎的程度优选为能过40?200目筛；更优选能过60?200目筛。
[0012]所述的嗜热厌氧梭菌为能够直接降解纤维素的嗜热厌氧梭菌，优选为嗜热厌氧梭菌 ATCC 27405。
[0013]所述的嗜热厌氧梭菌为处于对数生长期的嗜热厌氧梭菌，接种体积量优选为相当于发酵培养基体积的10%。
[0014]所述处于对数生长期的嗜热厌氧梭菌通过如下步骤制备得到:将嗜热厌氧梭菌(Clostridium thermocellum)在种子液培养基中经活化和扩大培养，得到处于对数生长期的嗜热厌氧梭菌。
[0015]所述的种子液培养基采用本领域常用的MTC培养基，以纤维素作为碳源。
[0016]所述的MTC培养基的组成如下:A’液、B液、C液、D液和E液按体积比40:2:1:1:1混合得到；
[0017]A’液中含有3g/L的纤维素，纤维素作为碳源液中含有柠檬酸钾50g/L、一水柠檬酸31.25g/L、硫酸钠25g/L、磷酸二氢钾25g/L和碳酸氢钠62.5g/L ；C液中含有氯化铵75g/L、尿素250g/L和酵母抽提物50g/L ；D液中含有六水氯化镁50g/L、氯化亚铁四水合物5g/L、二水氯化钙10g/L和L-半胱氨酸盐酸盐一水物50g/L ；E液中含有二盐酸吡哆胺Ig/L、对氨基苯甲酸0.2g/L、D-生物素0.lg/L、维生素B120.lg/L和维生素B10.2g/L。A’液、B液、C液、D液和E液中的溶剂为去离子水。
[0018]所述的活化的条件优选为:在1mL西林瓶中加入种子液培养基，再接种嗜热厌氧梭菌，于55?60 °C摇床培养48?72h。
[0019]所述的扩大培养的条件优选为:在10mL血清瓶中加入种子液培养基，再接种经活化后的嗜热厌氧梭菌，于55?60°C摇床培养48?72h或OD6tltl= 1.1?1.5。
[0020]所述的厌氧发酵的条件优选为:55?60°C摇床上厌氧发酵7?13天；更优选为55?60 °C摇床上厌氧发酵9天。
[0021]所述的摇床的转速为150?180rpm ;优选为150rpm。
[0022]所述的厌氧发酵优选通过如下操作步骤实现:在能密封的发酵容器中加入发酵培养基，密封，抽真空，充惰性气体，灭菌，再接种嗜热厌氧梭菌进行厌氧发酵。
[0023]所述的能密封的发酵容器优选为血清瓶。
[0024]所述的最终发酵培养基往所述能密封的发酵容器中的加入体积量优选为不超过所述能密封的发酵容器体积的1/2。
[0025]所述的惰性气体优选为氮气。
[0026]所述的充惰性气体的具体操作优选为??充0.0lMPa氮气3次。
[0027]所述的灭菌的条件优选为:115°C灭菌20min。
[0028]所述利用菇渣发酵产氢的方法在制备氢气中进行应用。
[0029]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0030](I)本发明发酵所用的原料是菇类农业生产后的废弃物一菇渣，总纤维素(纤维素及半纤维素)含量约为44% (wt，干重)左右，不需要经过复杂的酸碱预处理即可直接被微生物水解和利用，进行氢气的发酵，显著的降低了生产成本以及降低废弃菇渣所造成的环境污染问题，具有极其广阔的应用推广前景。
[0031](2)本发明通过嗜热厌氧菌集成生物工艺进行生物制氢省去了酶解糖化过程酶的生产成本，简化了传统分步糖化发酵工艺，有效降低了发酵过程杂菌污染的可能，可以有效降低投资费用和生产成本。
[0032](3)通过优化发酵条件可以显著的提高氢气的产量，提高底物的利用率和生产效率，降低生产成本。
【具体实施方式】
[0033]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0034]实施例1:菇渣直接烘干粉碎后在2%底物浓度下发酵产氢
[0035](I)嗜热厌氧梭菌(ATCC 27405)的种子液的制备:将_80°C保存的嗜热厌氧梭菌(Clostridium thermocellum)经 1mL 西林瓶 55°C摇床(150rpm)活化 72h，接着 10mL 血清瓶55°C摇床(150rpm)条件下放大培养72h，制得OD6c?约为1.3的种子液。其中活化和放大的培养基采用MTC培养基，培养基主要成份为A’、B、C、D、E液，5种成份按40:2:1:1:1 (v/v)用无菌注射器混合，溶剂为去离子水。A’液为3g/L的纤维素；B液:柠檬酸钾50g/L、一水柠檬酸31.25g/L、硫酸钠25g/L、磷酸二氢钾25g/L、碳酸氢钠62.5g/L ;(:液:氯化铵75g/L、尿素250g/L、酵母抽提物50g/L ；D液:六水氯化镁50g/L、氯化亚铁四水合物5g/L、二水氯化妈10g/L、L-半胱氨酸盐酸一水物50g/L出液:二盐酸R比唆胺lg/L、对氨基苯甲酸
0.2g/L、D-生物素 0.lg/L、维生素 B120.lg/L、维生素 B10.2g/L。
[0036](2)发酵培养基的制备及灭菌:将菇渣置于50°C烘箱中烘干至恒重，