一种藏药绿萝花中银椴苷的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药有效成分的提取纯化方法，具体是涉及一种从藏药绿萝花中提取 银椴苷苷的新方法。
【背景技术】
[0002] 藏药绿萝花ayrei/61)为瑞香科结香属植物，其花蕾似松球，表面披 着一层淡绿的茸毛，为喜马拉雅山脉高寒地区特有珍贵草本药材，性微寒，采其花蕾阴干泡 水，主治糖尿病、冠心病、高血压和各种血管炎症等疾病。2011年，太志刚等人从绿萝花中分 离得到黄酮、三萜和核苷类物质，其中，在分离实验初期就已证明绿萝花中含有大量银椴苷 物质（云鹿才孝/摩f论丈? 2011，131)。
[0003] 银椴苷具有较好〇-葡萄糖苷酶抑制活性的药理活性，2011年Kim等人从沙棘中 分离得到银椴苷（JArTic. /7OOt/CAeva2011，138)，并发现其具有较强的a-葡萄糖苷 酶抑制活性；2012年Wan等人从越橘蓝莓中分离得到银椴苷〇￡通.2012，1929)，再 次验证其具有较强的a_葡萄糖苷酶抑制活性；银椴苷在绿萝花中的含量较高，可以推测 银椴苷是治疗糖尿病的主要活性物质。另外，银椴苷还具有广泛的药理活性，2010年Sun 等人发现银椴苷具有可逆抑制3种人肝细胞色素P450酶的活性2010， 1670) ; 2012年Goto等人证明银椴苷通过激活脂联素提高肝脏脂肪酸从而改善肥胖所导 致的代谢紊乱（J；層/t汾'0.2012，768); 2014年Velagapudi等人发现银椴苷具有抑制 神经炎症的生物活性（万i〇.万2014，3311);相关文献也曾报道银椴苷具有抗炎、 抗氧化和抗肿瘤及保肝活性。
[0004] 基于银椴苷较好的药理活性，开发其分离方法具有较强的实际意义。文献和专利 报道了银椴苷的提取方法，专利（CN102311467A)报道了一种从结香中分离高纯度银椴苷 的新方法，利用超声提取、超滤、大孔树脂层析、高速逆流色谱分离纯化得到97%的银椴苷， 该方法工艺步骤繁琐，主要工段所使用的超滤膜易堵塞，成本高，高速逆流色谱设备庞大复 杂、溶剂体系难选，易乳化，溶剂耗量大，分离时间长，对于天然产物复杂体系，高速逆流色 谱不一定能达到常规生产要求；专利（CN103694293A)报道了一种檻木银椴苷的提取纯化 方法及检测方法，利用60%乙醇提取、大孔树脂层析、硅胶柱层析、聚酰胺粉层析、ODS层析、 MCI-gel柱层析等方法，最终分离得到96. 14%的银椴苷，该方法操作繁琐，反复使用层析手 段，不易扩大化生产，且层析材料能吸附原料，特别是硅胶材料能达到50%的吸附量，如此 之多的层析手段必然造成生产成本大幅提升，不具备开发价值。
【发明内容】
[0005] 本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种从藏药绿萝花中分离和回收银椴苷 的简便方法。
[0006] 本发明将分离和回收高纯银椴苷结合为一体，提供了一种提取、干法聚酰胺酚柱 层析和结晶分离银椴苷的简便方法，同时还利用助沉淀剂回收固液分离后所剩母液中的水 合和表面活性物质包裹的银椴苷，进一步将分离和回收的银椴苷合并后重结晶。
[0007] 本发明所述从绿萝花提取液中分离和回收银椴苷的步骤如下： (1) 将干燥的绿萝花粉碎至粒径1_5_，置于热回流提取罐中，并加入原料质量8-10倍 的乙醇溶液，搅拌混匀，50-60°C下回流提取2-3次，过滤，浓缩滤液所得粗提物用45-55°C 热水分散，冷却至室温后用氯仿重复萃取2-3次，氯仿萃取部分备用，剩余水相进一步用正 丁醇重复萃取2-3次，减压浓缩正丁醇萃取部分至固液比为1:2-1:4,冷却，硅藻土过滤得 滤液A; (2) 将滤液A与聚酰胺树脂按30-100g:IL比例混合后，减压抽干正丁醇溶剂后立即装 柱，然后用体积比为7:1、5:1、3:1、1:1和0:1的氯仿甲醇混合液依次梯度洗脱，合并氯仿甲 醇5:1和3:1的洗脱部分，加水萃取并回收氯仿后，剩余液体浓缩至无醇味，静置10-15h，固 液分离，得银椴苷沉淀物A和母液A; (3) 将母液A加热至70-80°C，添加助沉淀剂，冷却，静置10_15h，固液分离，得银椴苷沉 淀物B; (4) 合并银椴苷沉淀物A和银椴苷沉淀物B，重结晶、洗涤、60-70°C减压干燥，即得银椴 苷。
[0008] 所述重结晶是用质量百分比浓度为95%的乙醇溶液、甲醇、氯仿-甲醇溶液、氯 仿-乙醇溶液或乙酸乙酯-乙醇溶液进行；其中氯仿-甲醇溶液是氯仿和甲醇按体积比 1:1-7:1的比例混合；氯仿-乙醇溶液是氯仿和乙醇按体积比1:1-6:1的比例混合，乙酸乙 酯-乙醇溶液是乙酸乙酯和乙醇按体积比2:1-10:1的比例混合。
[0009] 所述助沉淀剂是甘草酸二胺、甘草酸钾、甘草酸钠或甘草次酸胺。
[0010] 所述步骤（1)中乙醇溶液为质量百分比浓度为60-70%的溶液。
[0011] 所述聚酰胺树脂的型号为CXSZ-60、CXSZ-100或CXSZ-120。
[0012] 关于上述浓缩至固液比是指一定体积溶液中溶质的质量与溶液体积的比，g:ml。
[0013] 本发明是对藏药绿萝花中银椴苷分离和回收的简便方法，步骤（1)采用热提取是 为了提高银椴苷溶解性，增加提取效率，采用水分散和氯仿萃取是为了去除小分子、糖、蛋 白、叶绿素等杂质，使用硅藻土过滤机是为了快速除去正丁醇萃取部分中的胶质、大分子蛋 白质、多糖、悬浮物等杂质；步骤（2)所使用聚酰胺树脂是常见的分离材料，采用干法装柱 是为使得绿萝花中的黄酮类物质充分吸附在聚酰胺树脂上，氯仿-甲醇作为梯度洗脱二元 溶剂，因为银椴苷大多出现在氯仿-甲醇5:1洗脱部分，少部分出现在3:1，所以合并5:1和 3:1洗脱部分，之后加水萃取的原因有2个，其一是将银椴苷转溶到甲醇水液中更有利于结 晶，其二是为了回收氯仿。结晶时浓缩至无醇味是为了最大限度的降低银椴苷的溶解度，使 其沉淀充分析出。以上提取手段虽然是常规的，但提取的工艺路线简单有效，产品纯度高， 易扩大化生产，至今没有文献和相关专利报道。
[0014] 步骤（3)中的母液A中还溶解少量的银椴苷，没有相关文献报道其回收方法。本 发明提供的方法是在70-80°C时向将母液B中添加助沉淀剂，冷却，静置，得银椴苷沉淀物 B。所添加的助沉淀剂是云南丰产植物甘草中制备得到的甘草酸二胺、甘草酸钾、甘草酸钠 或甘草次酸胺，它们在70-80°C时能破坏银椴苷中酚羟基与水形成氢键，减少水化作用，使 银椴苷析出。另外，植物提取物中存在诸如皂苷类、蛋白质、糖类、茶皂素、胆留醇等强表明 活性剂，70-80°C时添加甘草酸类有机盐能破坏以上表明活性剂对银椴苷的包裹，使其溶解 度显著减少，易于析出。
[0015] 本发明首次将分离和回收绿萝花中的银椴苷合为一体，充分利用了绿萝花药材资 源，与现有的银椴苷制备方法有着本质的区别。本发明提取工艺路线简单有效，具有极强的 实用性和可操作性，易扩大化生产。
【具体实施方式】
[0016] 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述 内容。
[0017] 实施例1:本藏药绿萝花中银椴苷的提取方法，具体操作如下： (1) 提取 取干燥的5. 0kg绿萝花(粒径为Imm)和40kg乙醇溶液(质量百分比浓度为70%)置于 热回流提取罐中，50°C回流提取3次，过滤，滤液浓缩，得粗提物（613.56g)，粗提物用1.5 kg热水（45°C)分散，冷却至室温后用氯仿萃取2次，氯仿萃取部分备用，剩余水相进一步用 正丁醇重复萃取3次；浓缩正丁醇萃取部分至固液比为1:2,冷却，硅藻土过滤得滤液A; (2) 聚酰胺树脂吸附和洗脱 聚酰胺树脂（GR，CXSZ-60)与滤液A按IL:30g比例混合，减压抽干正丁醇后干法装柱， 用体积比7:1、5:1、3:1、1:1和0:1的氯仿甲醇二元溶剂依次梯度洗脱，收集合并5:1和3:1 洗脱部分，加水回收氯仿，剩余液体浓缩至无醇味，静置l〇h，得银椴苷沉淀物A(55. 13g)和 母液A; (3) 回收银椴苷 将母液A加热至70°C，添加甘草酸钾，1小时后冷却，静置10h，固液分离，得银椴苷沉淀 物B(7.02g); (4) 重结晶 合并银椴苷沉淀物A和银椴苷沉淀物B，用氯仿-甲醇（4:1)混合液重结晶、洗涤、60 °(：减压干燥，得纯度90%以上的银椴苷（36. 67g)，得率为91. 77% ; (5) 银椴苷含量测定方法体系的建立 采用HPLC检测藏药绿萝花中银椴苷含量，具体检测方法如下： 分别称量1〇〇mg银椴苷，用甲醇（HPLC级)稀释并配制成1.00mg/mL的标准贮备液，取 标准贮备液分别制备为0. 01、0. 10、0. 20、0. 40、0. 80、I.OOmg/mL标准使用液，备用。另外， 称量1. 000g的样品，用甲醇配制成1. 00mg/mL的样品溶液，备用。
[0018] 以上配好的溶液经0.45ym的过滤膜后注入Agilent1200HPLC系统，色谱柱 为AgilentZORBAXSB-C18 (250mmX4.6, 5ym)，流动相由LO%甲酸水液和甲醇组成 (48 : 52)，流速为0. 8mL/min，柱温为25°C，UV检测波长为280nm，进样量10yl，保留 时间定性，外标法计算相应结果，结果见表1。
[0019] 实施例2:本藏药绿萝花中银椴苷的提取方法，具体操作如下： (1)取干燥的5.Okg绿萝花(粒径为2mm)和45kg乙醇溶液(质量百分比浓度为65 %) 置于热回流提取罐中，55°C回流提取2次，过滤，滤液浓缩得粗提物（638. 13g)，粗提物用 2.Okg热水（50°C)分散后，冷却至室温后用氯仿萃取3次，氯仿萃取部分备用，剩余水相进 一步用正丁醇重复萃取2次；减压浓缩正丁醇萃取部分至固液比为1:3,冷却，硅藻土过滤 得滤液A; (2) 聚酰胺酚材料（GR，CXSZ-60)与滤液A按IL:50g比例混合，减压抽干正丁醇溶剂 后干法上柱