br>[0047] 吸取650 y L上清加Tris饱和酪：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)800化，混摇lOmin， 4°C 12000;r/min 离屯、12min ;
[0048] 吸取 550 y L 上清，加氯仿 800 y L 混摇 lOmin，4°C 12000r/min 离屯、12min ; W例 W下步骤换1. 5ml的离屯、管 阳化0] 吸取450 y L上清，加无水乙醇800 y L 3M乙酸钢40 y L混摇6min，4°C lOOOr/min 离屯、8min ;
[0051] 弃上清，留下DNA沉淀团，加入1000 y L 70 %乙醇（自己配备），混摇5min， 4°C 100化/min离屯、5min，弃上清（如需要可重复一次）；
[0052] 将离屯、管放入通风楓，吹干至管内无小滴；
[0053] 样品加100 y L超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过Nano化op-100分光光度计检测 质量与浓度后将浓度同一稀释到l(K)ng/ y L左右于-20°C下保存备用。
[0054]二、该 SNP 位点（SNP 登录号为：rs80850169)的 PCR 扩增。
[0055] rs80850169SNP位点位于猪CYP17A1基因的第1个内含子上目的片段扩增并检测 突变所用的引物的核酸序列如下所示：
[0056] 正向引物（沈Q ID N0:2) :5, -CTGCAAGCCCCATCTGACTA-3，
[0057] 反向引物（沈Q ID N0:3) :5, -CAAAGCCCAGCACAGTAAGT-3，
[0058] PCR扩增反应总体系为50 y L :其中DM模板2. 0 y L、正、反向游引物各1. 0 y L、 PCR Mix试剂25 y ^超纯水21 y L ;所述的DM模板浓度为10化g/ y L所述引物的浓度为 lOmol/L 所述 PCR Mix 试剂为 hkara 的 rTaq,其 Code No :RR901A。
[0059] PCR扩增的反应程序为：96°C预变性5min ;96°C变性20s，52°C退火30s，72°C延伸 453,35个循环；延伸1〇111；[]1。
[0060] 本实施例中，PCR扩增产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR 产物，片段全长为493bp (结果见图2)。
[0061] S、PCR-Msp I -RFLP 检测该 SNP 分子标记。 阳06引 Msp I酶切体系为50化：其中Msp I限制性内切酶l.OyUPCR扩增产物6. 0化、 化tSmartTM Buffer 5. Oul、超纯水：38 y L酶切溫度为37°C，反应时间15分钟。所述的 Msp I限制性内切酶和化tSmartTM Buffer购于化W化gland Bi化油S公司，货号分别为： #30106￥和#872045。本实施例中，酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后紫外灯下检测 拍照，记录基因型（结果见图3)。 W63] 实施例3
[0064] 100头母猪外周血雌激素和孕激素浓度检测
[0065] 本发明所使用猪群体外周血中血清雌激素和孕激素浓度的检测放射免疫法检测。
[0066] 实施例4SNP标记与母猪雌激素和孕激素浓度的关联分析
[0067] 为了研究发情征状与雌激素和孕激素浓度的关系，我们在江苏永康农牧有限公司 对200头外种母猪在发情期的11个发情征状（阴户肿胀、阴户颜色、阴道粘膜颜色、黏液的 量、黏液稀稠度、精神状态、爬跨行为、发呆行为、采食情形、母猪叫声和静立反射）进行了 评定，同时在发情中期采血样，测定了母猪在发情期血清中的雌激素和孕激素的浓度，结果 表明母猪发情期血清中雌激素的含量与阴户肿胀、阴户颜色、阴道粘膜颜色、黏液稀稠度和 静立反射运5个发情征状存在显著的相关性（P<0. 05)。
[0068] 对运个群体中的随机选取的100头母猪血清中的雌激素和孕激素含量进行测定， 同时检测SNP rs80850169的多态性，结果发现，TT型的雌激素浓度显著高于CC型，差异极 显著（P = 0. 007<0. 01)。 W例表1不同基因型母猪发情期血清中雌激素和孕激素的浓度 [0070]
[0071] **表示差异极显著（P<0. 01)。
[0072] 对运=种基因母猪的发情征状进行分析也发现，不同基因型母猪发情期的阴户颜 色和静立反射运两项发情征状的评分有显著的差异（P<〇. 05)。结果证明该SNP位点可W用 于母猪发情期雌激素浓度和发情征状强弱的筛选。
【主权项】
1. 与母猪发情征状及发情期血清雌激素浓度相关的分子遗传SNP标记，其特征在于， 所述SNP标记位于猪14号染色体上的CYP17A1基因的核苷酸序列上，所述SNP标记位点 rs80850169为国际猪基因组10. 2版本参考序列猪14号染色体上g. 123778229核苷酸位 点，该位点的等位基因为C和T，有CC、CT和TT三种基因型；所述的SNP标记与母猪发情期 血清雌激素浓度和发情征状的表现强度显著相关。2. -种基于权利要求1所述的SNP标记开发分子标记的方法，其特征在于以含有权利 要求1所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以"长白猪X大白猪"杂种 母猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使权利要求1所述的SNP标记转化为分子标记。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的引物对序列为上游引物：SEQ ID NO :2,下游引物：SEQ ID NO :3;所述的分子标记序列如SEQ ID NO: 1所示，所述的SNP位点 位于第316位，存在T/C多态性。4. 按照权利要求2或3所述的方法得到的分子标记。5. 根据权利要求4所述的分子标记，其特征在于分子标记序列如SEQ ID NO :1所示， 所述的SNP位点位于第316位，存在T/C多态性。6. -种用于检测权利要求1所述的SNP标记的引物对，其特征在于上游引物为：SEQ ID NO :2,下游引物为：SEQ ID NO :3。7. -种检测权利要求1所述的SNP标记的方法，其特征在于包含PCR扩增"长白猪X 大白猪"杂种母猪基因组中含有权利要求1所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测 序，判读该位点的T/C多态性。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 取"长白猪X大白猪"杂种母猪的耳组织样品并提取总DNA ; (2) 用已提取的"长白猪X大白猪"杂种母猪基因组DNA为模板，使用权利要求6所述 的引物进行PCR扩增； (3) 将PCR扩增产物使用Msp I限制性内切酶进行酶切，分析酶切结果，根据酶切结果 判断在SEQ ID NO :1第316位的T/C多态性。9. 权利要求1所述的SNP标记、权利要求4或5所述的分子标记、权利要求6所述的引 物在筛选发情期高血清雌激素浓度以及发情症状强的"长白猪X大白猪"杂种母猪品系中 的应用。10. -种筛选发情期高血清雌激素浓度以及发情症状强的"长白猪X大白猪"杂 种母猪品系的方法，其特征在于包括检测"长白猪X大白猪"杂种母猪14号染色体上 g. 123778229核苷酸位点的基因型，选育该核苷酸位点的TT型个体作为种猪。
【专利摘要】本发明公开了与母猪发情征状相关的分子遗传SNP标记及其检测方法和应用。所述SNP标记位于猪14号染色体上的CYP17A1基因的核苷酸序列上，所述SNP标记位点rs80850169为国际猪基因组10.2版本参考序列猪14号染色体上g.123778229核苷酸位点。本发明发现：该SNP位点与发情期母猪血清中雌激素浓度极显著相关。该分子标记在母猪发情鉴定中的应用，为母猪发情鉴定选育提供一个新的分子遗传标记。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105002168
【申请号】CN201510436096
【发明人】周波, 李会智
【申请人】南京农业大学, 南京农业大学淮安研究院
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月22日