一种具有抗乳腺癌活性的寡肽的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是下述申请的分案申请：
[0002] 【申请号】2014101695347
[0003] 申请日：2014年4月25日
[0004]发明名称：具有抗乳腺癌活性的寡肽及其应用
技术领域
[0005] 本发明涉及一种寡肽，尤其涉及一种具有抗乳腺癌活性的寡肽，属生物医学领域。
【背景技术】
[0006] 乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女发生乳腺 癌，占女性所有肿瘤的18%。乳腺癌5年生存率约50% -60%，近50%患者治疗后复发转 移，晚期乳腺癌患者平均生存时间仅18-30个月。乳腺癌的治疗手段包括手术治疗、放射治 疗、化学药物治疗、内分泌治疗等传统的治疗手段。但手术治疗风险高，对人体创伤大，使患 者免疫力降低，对疾病抵抗力下降，术后易产生一系列手术并发症且仅为局部治疗手段，只 适用于早期患者，对中、晚期患者来说，即使能手术效果也不理想，难以根治。由于乳腺癌 的复发和转移特性，放射治疗对肿瘤的局部控制效应不如外科手术，且对照射区的正常组 织也有杀伤作用，同时亦可导致乏力、恶心、食欲不振等全身不良反应；放射线本身亦可造 成医源性损伤，如放射性脊髓炎、放射性肺炎、放射性脑坏死等。虽然肿瘤的化疗近年来发 展很快，但对大多数实体瘤而言，根除性化疗的前途仍不容乐观。另外，化疗药物在抑制肿 瘤细胞生长或杀伤癌细胞的同时，对机体内正常繁殖的各类细胞同样也有不同程度的毒性 作用，尤其是骨髓造血细胞和胃粘膜上皮细胞受到的损害最重。另外，化疗药物的严重毒副 反应，以及多药耐药等，仍然是十分棘手的问题。由于乳腺癌是一种与内分泌密切相关的肿 瘤，内分泌治疗已成为乳腺癌各阶段的重要治疗手段，但也会产生一定的副作用。
[0007] 多肽、蛋白质类药物具有活性高、疗效稳定、毒副作用小、用量少等优点，对癌症、 自身免疫性疾病、记忆力减退、精神失常、高血压和某些心血管及代谢等疾病有显著的疗效 和广泛的应用前景，因此备受国内外专家的关注。自1953年人工合成了第一个有生物活性 的多肽催产素以后，50年代的研究主要集中在脑垂体所分泌的各种多肽激素并取得了很大 的进展。到60年代，研究的重点转移到一类典型的神经细胞所分泌的活性肽（神经肽），即 由下丘脑所形成的激素释放因子和释放激素抑制因子。70年代，脑啡肽及脑中其他阿片样 肽的相继发现，使神经肽的研究又进入了高潮，在研究脑活性肽（脑肽）的同时，胃肠激素 的研究也十分活跃，成为发展较快的一个研究领域。近年来，随着生物技术的不断发展，利 用生物技术合成并研究了多种多肽类药物，已经成为了药物研究的热点问题。随着医疗科 学的不断发展，多肽类药物已成为21世纪重要的诊断、监测、预防和治疗药。
[0008]自然界中存在着大量的生物活性多肽，它们在生物活动中起着非常重要的调节作 用，涉及分子识别、信号识别、细胞分化及个体发育等诸多领域。人们发现存在于生物体的 多肽有数万种，并且发现所有的细胞均能合成多肽。同时，几乎所有的细胞也都受多肽调 节，它涉及激素、神经、细胞生长与生殖等各个领域。应用这些活性肽可作为药物、疫苗、导 向药物、诊断试剂及药物先导化合物等。因此，开展生物活性肽研究具有广泛的理论和应用 价值。
[0009] 存在于体内的信号分子有相当数量是肽和蛋白质，许多疾病的发生、发展均与这 些物质的失衡有关。因此，源于生物体本身的蛋白质、多肽类药物日益受到重视，它们被称 为内源性活性肽或蛋白质。由于生物活性肽在体内含量极少而效应极强，分布广泛，因而为 多种药物研发提供了天然先导化合物。自然界存在的多肽，除了有些是蛋白质降解产生的 活性肽段外，生物体内已知的活性多肽主要是下丘脑、垂体、胃肠道等产生的多种具有特殊 生理作用的激素。
[0010] 生物活性肽早期主要从天然动、植物、昆虫等生物体内分离扩取，周期长，成本高。 80年代末及90年代初出现的生物（基因）组合肽库及化学组合肽库，给肽类药物以及制药 工业到来了革命性进展。目前主要从生物肽库（噬菌体、细菌、酶菌及哺乳动物细胞表面展 示肽库）内筛选生物活性多肽。
[0011] 生物组合肽库及化学组合肽库的构建和筛选涉及化学、计算机分子设计、分子生 物学、药学等多学科，是这些学科的重要生长点，并将成为将基因组、蛋白质组、疾病分子生 物学及结构生物学等最新成果推向应用的强有力手段。生物肽库是通过四个碱基的随即组 合，合成各种随机序列的DNA片段，将这些随机序列DNA片段克隆至原核或真核细胞表达载 体，与细菌、噬菌体或真核细胞的表面蛋白或鞭毛蛋白融合表达，使这些表达的随机序列多 肽展示在细胞表面。近10年国内外多生物多肽进行大量基础和应用研究，并已将多种多肽 药物和诊断试剂应用临床。
[0012] 多肽合成的方法学在不断的发展和创新，肽的化学合成至今一直是肽研究的一个 重要方面。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从C端（羧基端）向N端（氨 基端）合成。自从1963年Merrifidld发展成功了固相多肽合成方法以来，此方法合成步 骤简单，同时能够得到高纯度肽类物质，克服了传统液相合成费时和烦琐，又解决了操作步 骤多带来的损失，也为多肽自动合成奠定了基础，经过不断的改进和完善，到今天固相合成 法已成为多肽和蛋白质合成中的一个常用技术。
[0013] 固相合成多肽的主要步骤是：通过简单的脱去氨基保护，连接一个氨基酸，再脱去 氨基保护，再接下一个氨基酸的简单重复，就可以很容易的得到所需要的肽段。待所要的肽 段合成完毕后，就可以采用化学试剂将多肽从树脂上洗脱下来，同时使用合适的试剂将多 肽的侧链保护基团也切割除掉，这样就得到了与完整的生物体内的多肽完全一样的产物。
[0014] 该方法比液相合成法有极大优势，比如每一步连接方式简单；氨基末端保护方式 相同，除去该保护基团方法简单；羧基末端由于一直连接在树脂载体上，不需要保护；每步 的中间产品不需要纯化，只需要简单的洗涤树脂；化学偶联效率高。因此，现在越来越多的 使用该方法合成多肽。而且由于这种接肽的方法是使用重复简单的方式方法，可以很容易 的采用自动控制的仪器完成，因此设计和使用这种仪器已经变得越来越简单，能更快更好 的掌握这种方法来合成多肽进行研究。
[0015] 多肽合成方法不断丰富和完善，合成的效率大大提高，必将进一步促进活性肽的 结构和功能关系的研究，开拓多肽生物学研究的新领域。
[0016] 多肽作为药物有其独特的优点：（1)分子量小，无免疫原性、比较安全；(2)结构相 对简单，功能较明确、特异、副作用小；（3)分子较小，易于合成，生产成本低：(4)多肽药物 易于从多途径吸收，因此给药途径可多样化（如口服、喷雾、透皮吸收等）；（5)合成的多肽 纯度较高，不存在热源问题。
[0017] 正因如此，国内外对多肽药物的研究特别重视。多肽类药物的化学本质具有生物 活性的小分子物质，它们参与人体许多重要的生理过程，比如造血、抑制肿瘤细胞活性、免 疫等，因此这类药物往往作用机理明确，效果明显，具有很高的临床应用价值。
[0018] 多肽药物依据不同用途或靶向目标，可分为9大类，主要包括多肽疫苗、抗肿瘤多 肽、抗病毒多肽、多肽导向药物、细胞因子模拟肽、抗菌性活性肽、用于心血管疾病的多肽、 其他药用小肽、诊断用多肽等。
【发明内容】
[0019] 基于肽类药物的基本特性以及乳腺癌临床治疗中的需要，本发明的目的是提供一 种具有抗乳腺癌活性的寡肽及其应用。
[0020] 本发明通过提取国际主要抗菌肽数据库中登录的抗菌肽序列，分析其一级结构与 活性的对应关系，同时设计人工短肽序列。分析已知活性的寡肽序列与设计的寡肽序列的 二级结构的相似度，结合其它物理化学参数预测进行设计序列的修正，并利用本领域常规 的液相或固相合成法人工合成高纯度的全序列，经质谱鉴定、抗癌活性筛选，最终确定具有 抗乳腺癌功能的寡肽。
[0021] 本发明筛选得到的具有抗乳腺癌活性的寡肽其序列为Phe-Thr-Gln-Tyr-Pro-Lys -Arg-Gly-Ser。该寡肽氨基酸数目小于10个，不需任何修饰连接，为线性寡肽，且人工合成 方便；功能实验显示，该寡肽能显著抑制乳腺癌细胞株的生长，并能有效抑制小鼠体内肿瘤 的增殖，提示其在乳腺癌临床治疗中具有重要的开发和应用价值，因此可用于制备抗乳腺 癌药物。
[0022] 本发明与现有技术相比具有如下效果：
[0023] 本发明合成了一个具有很强抑制乳腺癌活性的寡肽。目前虽有文