一种肺癌预后预测miRNA检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医用诊断技术领域，涉及肺癌的预后领域，主要是肺癌化疗后死亡危 险度的预测，特别是涉及用于肺癌诊断的一组外周血miRNA的检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是全世界范围内肿瘤死亡的首要原因，在中国，肺癌的发病率逐年升高，死亡 率也是位居肿瘤死亡首位。据世界卫生组织（WHO)估计，截至2025年，我国每年肺癌死亡 病例将达到 100 万（JemalA，BrayF，CenterMM，etal.Globalcancerstatistics.CA CancerJClin,2011,61(2) :69-90;SheJ,YangP,HongQ,etal.LungcancerinChina： challengesandinterventions.Chest, 2013,143 (4) :1117-1126.)。近年来，尽管肺癌 的诊断和临床治疗已取得很大进展，但患者的总生存时间仍很短，5年生存率不超过15%。 目前的治疗手段对肺癌总生存率的提高效果不大，II-IV期肺癌患者5年生存率大约在 40% -5%之间，而I期患者5年生存率可高达92%。
[0003] 基于外周血的分子标志物筛选是多年来肿瘤早期诊断研究的热点，因为血液检测 微创，成本相对较低，可重复性高。其中，血清microRNA(miRNA)作为肿瘤标志物是目前最 有吸引力的分子标志物。因为血清miRNA容易分离，并且非常稳定，即便是在苛刻的条件 下，如反复冻融和PH值改变等环境下也不容易降解。miRNA是近年来发现的一类长度为 19-25个核苷酸的非编码小分子RNA。它主要通过与靶标基因3' UTR的完全或不完全配 对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生 命活动，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能。
[0004] 目前已经证实，miRNA在组织和细胞中的表达表现为显著的肿瘤相关性、组织 特异性和表达稳定性（Lu J，Getz G，et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature.2005,435(7043) :834-838；Cho WC. Oncomirs ：the discovery and progress of microRNAs in cancers. Mol Cancer.2007,6:60)。并且miRNA在外周血中的 表达同样具有肿瘤相关性和组织特异性，同时与RNA比较，其表达稳定性更为显著。研究表 明通过检测血浆或血清中的miRNA以诊断疾病是可行的、稳定的及具有可重复性的。因此， 有必要也有可能寻找血循环中的特异的肿瘤标志物，以期建立一种无创、快速、稳定且经济 的肺癌诊断方法。
【发明内容】
[0005]目前肿瘤标志物和其他无创的筛选手段存在灵敏度低、特异性差以及对仪器设备 要求较高的问题，为了解决这一问题，本发明的目的是选取肺癌特异性的miRNAs作为肿瘤 标志物。本发明的目的是提供一种检测外周血miRNA表达水平的荧光定量PCR试剂盒及使 用方法，该试剂盒适用于目前市场上存在的各种类型的荧光定量基因扩增仪，定量快速准 确、灵敏度高、稳定性好、具有良好的应用前景。
[0006] 本发明的另一目的是提供了一种荧光定量PCR试剂盒，其通过检测肺癌病人外周 血中miRNA的水平对肺癌预后预测进行快速的检测。
[0007] 为了实现上述目的，本发明通过收集首诊患者并且术前未接受辅助化疗，术后辅 助化疗的病人进行跟踪检测，对不同肺癌患者和正常人外周血样品，进行全基因组miRNA 差异表达分析，发现及验证不同肺癌外周血特异性miRNA，检测候选miRNA表达谱在这些样 本中的表达，统计分析药物治疗前后miRNA的改变与预后关系的相关性，将筛选出的特异 的miRNAs用于在肺癌高危人群中早期肺癌诊断及病人预后预测。
[0008] 本发明人在研究中发现hsa-miR-10b_5p、hsa-miR-141_3p在术后辅助化疗的病 人中有明显的表达量变化，其表达量与病人的预后呈正相关关系。将hsa-miR-10b-5p、 hsa-miR-141-3p作为肺癌筛查的分子标志物具有非常重要的应用价值。前期研究表明 hSa-miR-10b-5p、hsa-miR-141-3p的表达水平高低与病人的预后具有明显的依赖关系。作 用于肺癌的治疗后的复发、转移及预后预测具有非常重要的临床意义。
[0009] 该组生物标志物还可以应用于肺癌的诊断。
[0010] 此外，本发明还提供了一种利用上述生物标志物进行肺癌预后预测的方法，具有 包括以下步骤：
[0011] ⑴收集人外周血样本；
[0012] (2)提取血清中总RNA;
[0013] (3)对hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-141-3p生物标志物进行反转录和实时定量PCR， 并计算每个生物标志物的PCR相对定量值。
[0014] (4)根据每个生物标志物的PCR相对量值计算P值，当P值大于0. 6523时，则认为 预测病人经化疗后预后不佳，小于〇. 6523时，则认为预测病人经化疗后预后良好。
[0015] 本发明的内容包括建立一个miRNA表达谱、筛选肺癌特异性miRNAs、通过特异性 引物对筛选出的miRNAs进行定量分析，开发一种具有高灵敏度、高特异性和低成本等优点 的外周血特异性miRNAs定量检测试剂盒，为指导病人的个体化治疗及判断肺癌的预后提 供一种新的可靠指标。
[0016] 通过对阳性样品的检测，发现本试剂盒检测准确率达97% .连续3次重复实验，实 验结果稳定。
【附图说明】
[0017]图 1 正常人hsa-miR-10b_5p、hsa-miR-141_3p及U6snRNA扩增曲线图
[0018]图 2 肺癌患者has-miRNA-lOb、hsa-miR-141 及U6snRNA扩增曲线图
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，以下实例仅用于说明本发明，而不用于 限制本发明的范围。实例中为注明具体的实验方法，按照制造试剂盒生产公司所建议的条 件或按照常规实验条件或实验室手册中所述的条件。
[0020] 实例1肺癌病人外周血中miRNA生物标志物组合的建立
[0021] -材料和方法
[0022] 1、材料
[0023] 肺癌病人外周血均来自武汉大学人民医院2012-2014因肺癌住院病例，分别取30 例肺癌病人和20例正常人外周血。
[0024] 2、方法
[0025] 2. 1、外周血总RNA的提取
[0026] 按Triazol试剂盒说明书提取肺癌病人外周血细胞的总RNA，通过凝胶电泳证明 RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。主要步骤如下：
[0027] (1)收集病人外周血，离心收集细胞，每管加入ImLTrizol试剂，混匀，室温放置 5min。加入氯仿200iiL，用力振荡15sec，室温孵育2~3min。
[0028] (2)在4°C下以12000Xg的速度离心15min，混合物分为红色的酚-氯仿相（下 相）、白色的中间相以及无色的上层水相。总RNA分散在上层水相中。
[0029] (3)将上层水相（500liL)转移到一个新的Eppendorf管中，加入ImL无水乙醇，混 匀以沉淀RNA。
[0030] (4)室温孵育IOmin以上，在4°C下以12000Xg的速度离心lOmin，可见白色的RNA 沉淀贴于试管底壁。
[0031] (5)弃上清，用70%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，在4°C下以7500Xg的速度离心 5min〇
[0032] (6)弃上清，空气中自然干燥，用60iiLDFPC水溶解沉淀，_70°C保存备用。
[0033](7)总RNA完整性鉴定：取2iiLRNA样品在L5%琼脂糖凝胶电泳（60v，30min)， 分出区带后EB染色，紫外灯下拍照观察。
[0034] (8)用核酸蛋白仪测定RNA的浓度及纯度
[0035] 2. 2基因芯片杂交
[0036] 取IOOng提取的外周血miRNA，使用安捷伦公司的miRNACompleteLabelingand Hyb试剂盒，按照说明书步骤进行样本的标记和浓缩，使用安捷伦公司的人miRNA表达谱芯 片进行杂交。使用芯片扫描仪进行图像扫描以后，把数据导入GeneSpringCXlLO软件进 行数据的标准化处理及后续的分析，将芯片归一化后的有效数据应用专业软件进行聚类分 析。
[0037] 2. 3数据分析和验证
[0038] 芯片数据分析发现，来源于肺癌患者和正常人的样本都各自聚集在一起，提示外 周血miRNA表达谱可以区分不同来源的样本。利用t检验、聚类分析等生物信息学手段进 行差异基因表达分析，探寻可能的差异基因，进一步qRT-PCR进行验证，最后筛选出特异性 的表达上调的 2 个miRNA:hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-141_3p。
[0039] 实例2应用miRNA:hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-141-3p对肺癌患者进行检测的方法
[0040] 1.收集肺癌患者外周血样本。
[0041] 2.按照实例1的方法提取总RNA。
[0042] 3?反转录和Realtime-PCR
[0043]取IOOng所提取的RNA使用promega公司的ReverseTranscription反转录 试剂盒进行反转录。20iiL反应体系：100ng提取的RNA，5XRTbuffer4iiL，AMVreverse transcriptasemixluL，Rnasefreewater补足至 20uL。在per仪上进行反转录，条件 为：37°C，1小时，95°C，5分钟。
[0044] 取I. 5iiL的反转录产物作为实时定量PCR反应的模板，使用Qigan公司的SYBR GreenPCR试剂盒进行实时定量PCR，反应以U6snRNA为内参。反应体系为：1.5iiL反转 录产物，2XQuantiTestSYBRGreenPCRMasterMixl0iiL，10XmiSc;riptUniversal Primer2uL，特异性引物（序列见SEQIDN0.3、SEQIDN0.4、SEQIDN0.5SEQIDN0.6SEQ IDNO. 7 和SEQIDNO. 8) 2UL，Rnasefreewater补足至 20UL。反应条件：95°C10 分钟 预热，94°C15 秒，55°C30 秒，70°C30 秒，40 个循环。
[0045] 预后预测
[0046] 各个生物标志物的PCR相对量使用2Aet公式来计算，其中ACt=Ct-CtU6。 结果显不在经化疗后的预后较差的病人中miRNA:hsa-miR-10b_5p、hsa-miR-141_3p表达 量均明显上调，见附图1、附图2,而且各批次间重复性好。
【主权项】
1. 用于诊断或检测肿瘤的分子标志物，其特征在于：其为SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2 所示的miRNA。2. 权利要求1所述的分子标志物作为靶标在制备诊断肿瘤试剂中的用途。3. 权利要求1所述的分子标志物作为靶标在制备评判肿瘤病人治疗后预后试剂中的 用途。4. 用于诊断或评估肿瘤病人预后的特异性引物，其特征在于：其为SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5SEQ ID NO. 6SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示的碱基序列。5. -种用于诊断肺癌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求4 所述的特异性引物。6. -种用于评估肺癌病人预后的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有 权利要求4所述的特异性引物。7. 根据权利要求5或6所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，还包括：标准DNA模 板、Hot-start Taq DNA 聚合酶，10 X PCR buffer，10mmol/L dNTP 混合物。
【专利摘要】本发明涉及了检测肺癌外周血miRNA变化的试剂盒。本发明包含了一种试剂盒及其使用方法，试剂盒包括以下成分：特异性引物、特异性探针、U6snRNA引物、荧光PCR反应液。其检测方法为：收集病人外周血样本，提取血液中总RNA；利用试剂盒进行实时定量PCR，可以快速大量检测hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-141-3p的表达量；通过与内参U6snRNA的对此，从而对肺癌病人进行预后预测。本发明操作简单、快速、重复性好、特异性强且灵敏度高。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105087758
【申请号】CN201410186710
【发明人】陈建华, 张礼斌
【申请人】陈建华
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月6日