专利名称：通过mapkapk2基因检测肺癌易感性和判断肺癌预后的试剂盒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种通过MAPKAPK2基因检 测肺癌易感性和判断肺癌预后的试剂盒及其用途，通过检测MAPK激活的蛋白激酶_2 (MAPK activated protein-kinase 2，MAPKAPK2)的单核苷酸多态性(SNP)位点来预测肺癌的易 感性，并且能判断肺癌患者的预后。属于医疗研究领域。
背景技术：
原发性支气管肺癌，简称肺癌，是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之 一。由于肺癌常伴早期转移，70%的肺癌病人发现时已是晚期，其5年生存率目前的平均水 平只有16%，其病情发展速度与肺癌细胞的生物特性有关。肺癌是一种严重威胁人类健康 和生命的疾病。2009年美国报告新发肺癌219，440例，死亡159，390例(死亡率53. 80/10 万)。广州死亡登记的数据标明1970 1972年肺癌死亡率为11. 61/10万，1980 1982 年升为32. 67/10万，而2000 2002年更上升至48. 79/10万。上海、天津等大城市死亡登 记的数据也都显示肺癌的死亡率在数十年间急剧上升。肺癌病因和发病机制尚未完全明确。目前一致认为吸烟、空气污染、放射线、肺结 核及镍化合物等职业危害是肺癌的危险因素。这些危险因素对细胞而言都是刺激信息，可 激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号传导通路。 MAPK信号通路进一步调控细胞凋亡、炎症反应及细胞增殖等过程，导致肿瘤发生。近年来研 究显示很多MAPK基因在各种类型肺癌中均有基因表达的改变，而在非小细胞肺癌中发现 了很多MAPK基因的突变。对MAPK基因的深入研究将为肺癌的基因预防和治疗提供理论基 石出。SNP(Single nucleotide polymorphism)，即单核苷酸多态性，是人类基因组作图 的第三代遗传标记，主要是指一类基于单碱基变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转 换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组最广泛存在的一类多态性标记，已成为 研究基因组多态性和识别、定位疾病相关的一种工具。1996年成功研制了 SNP检测的实时 荧光定量PCR技术，实现了 PCR从定性到定量的飞跃，还实现了判断结果的自动性。可利用 荧光定量PCR技术研发检测疾病易感性及判断疾病预后的试剂盒。MAPKAPK2基因位于第1号染色体lq32位置，总长约49kb，由10个外显子组成，编 码400个氨基酸的MAPKAPK2蛋白质。MAPKAPK2基因编码蛋白是一个多功能的蛋白激酶，是 MAPK的重要效应底物。它可通过调节抑癌蛋白tuberin，而调控细胞周期和细胞间粘连等 功能；可影响肺上皮细胞的抗氧化功能；也可激活热休克蛋白HSP27、HSP25，抑制细胞凋亡 和细胞运动；还可通过调节肿瘤坏死因子TNF等的分泌影响巨噬细胞和树突状细胞功能， 调节机体对外源感染的抵抗力。在照射损伤的情况下，MAPKAPK2可调节DNA修复基因ATM 和/或ATR启动的细胞周期检测点，影响机体细胞对DNA损伤的修复。此外，在动物肺癌模 型中，发现以MAPKAPK2过高表达为肺组织病理改变的重要特征。提示MAPKAPK2可通过多个途径参与细胞癌变的过程。不仅如此，MAPKAPK2还是一种近年来发现的重要细胞周期检 测点调控，影响顺钼、喜树碱及阿霉素杀伤肿瘤细胞的效果；它还可通过激活LIM分子，参 与VEGF刺激导致的肿瘤血管生成过。提示MAPKAPK2可能与肺癌的预后相关。rs4844550是位于第1号染色体lq32的MAPKAPK2基因启动子区域的一个A > G 多态。其在世界人群的频率分布，A占0.91，G占0.09左右。中国人群的分布A占0.93，G 占0. 07左右。分子生物学研究表明，A > G的替代导致MAPKAPK2基因启动子失去了转录 因子-芳烃受体抑制因子(AHR repressor, AHRR)结合的位点，增加了 MAPKAPK2基因的表 达。通过大规模人群的肺癌病例对照研究，MAPKAPK2基因启动子区域的A > G多态与肺癌 发生相关，这种关联在年轻< 60岁者及有肿瘤家族史者尤为明显。此外还发现该位点的遗 传变异与肺癌患者的预后相关，肺癌患者基因型携带有G时，预后差。这个SNP的多态可用 于检测个体肺癌的易感性，及可用于判断肺癌患者的预后。
发明内容
本发明的目的第一个目的，是为了提供一种通过MAPKAPK2基因检测肺癌易感性 和判断肺癌预后的试剂盒，是一种通过MAPKAPK2基因上的rs4844550位点检测肺癌易感性 和判断肺癌预后的试剂盒。本发明的第二个目的，是为了提供一种通过MAPKAPK2基因检测肺癌易感性和判 断肺癌预后的试剂盒的用途。本发明的第一个目的可以通过以下技术方案实现通过MAPKAPK2基因检测肺癌易感性和判断肺癌预后的试剂盒，其特征在于1)该试剂盒的物质包括检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异 性引物对及特异性荧光探针对、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgC12溶液、荧光定量PCR反 应缓冲液和去离子水；2)所述检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性引物对的序列包 括有义引物序列和反义引物序列；所述检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特 异性荧光探针对包括野生型探针序列和突变型探针序列；3)所述的特异性引物能特异性扩增出包含针对MAPKAPK2基因上的rs4844550号 SNP位点的DNA引物对和DNA探针对。实现本发明第一目的的一种实施方案是试剂盒中供一人份使用的各成分的含量 为1)10 μ M特异性引物对有义引物序列和反义引物序列各0.225 μ 1，5 μ M特异性荧 光探针对野生型探针序列和突变型探针序列各0. 1 μ 1 ；2) 5unit/ μ ITaq DNA 聚合酶 0. 02 μ 1 ；3) 20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；4)25mM MgC12 溶液 0· 5μ 1 ；5) 5Χ荧光定量PCR反应缓冲液2 μ 1 ；6)去离子水 4.1 μ 1。实现本发明第一目的的一种实施方案是所述检测ΜΑΡΚΑΡΚ2基因上的rs4844550 号SNP位点的特异性引物对的序列如序列表SEQ ID N2 :1所示，有义引物序列的Tm值为59°C，反义引物序列的Tm值为58°C ；所述检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点 的特异性荧光探针对的序列如序列表SEQ ID N2 2所示，野生型探针序列的Tm值为68°C， 突变型探针序列的Tm值为68 °C。实现本发明第一目的的一种实施方案是试剂盒的保存温度为-20°C。本发明的第一个目的可以通过以下技术方案实现通过MAPKAPK2基因检测肺癌易感性和判断肺癌预后的试剂盒，其物征在于用于 检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的基因型。本发明具有如下突出的有益效果1、本发明是针对MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点而设计，可通过调节抑 癌蛋白tuberin，而调控细胞周期和细胞间粘连等功能；可影响肺上皮细胞的抗氧化功能； 也可激活热休克蛋白HSP27、HSP25，抑制细胞凋亡和细胞运动；还可通过调节肿瘤坏死因 子TNF等的分泌影响巨噬细胞和树突状细胞功能，调节机体对外源感染的抵抗力。2、本发明MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的遗传变异与肺癌患者的预 后相关，这个SNP的多态可用于检测个体肺癌的易感性，且可用于判断肺癌患者的预后，可 广泛应用于医疗研究。
具体实施例方式具体实施例1 本实施例包括1)该试剂盒的物质包括检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异 性引物对及特异性荧光探针对、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgC12溶液、荧光定量PCR反 应缓冲液和去离子水；2)所述检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性引物对的序列包 括有义引物序列和反义引物序列；所述检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特 异性荧光探针对包括野生型探针序列和突变型探针序列；3)所述的特异性引物能特异性扩增出包含针对MAPKAPK2基因上的rs4844550号 SNP位点的DNA引物对和DNA探针对。本实施例中，所述检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性引物对 的序列如序列表SEQ ID N2 :1所示，有义引物序列的Tm值为59°C，反义引物序列的Tm值 为58°C ；所述检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性荧光探针对的序列 如序列表SEQ ID No 2所示，野生型探针序列的Tm值为68°C，突变型探针序列的Tm值为 68 "C。试剂盒中供一人份使用的各成分的含量为1)10 μ M特异性引物对有义引物序列和反义引物序列各0.225 μ 1，5 μ M特异性 荧光探针对野生型探针序列和突变型探针序列各0. 1μ 1 ；2)5unit/y ITaq DNA聚合酶 0.02 μ 1 ； 3)20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；4)25mM MgCl2 溶液 0.5 μ 1 ； 5) 5Χ 荧光定量 PCR 反应 缓冲液2μ 1 ；6)去离子水4. 1 μ 1。试剂盒的保存温度为_20°C。本发明的应用实施例1 检测试剂盒的使用
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步骤1:DNA模板的提取用硅胶吸附法提取血液标本的基因组DNA。步骤2 荧光定量PCR反应使用本发明的荧光定量PCR检测试剂盒，其中包括下列引物对和荧光探针，均针 对MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点有义引物1 :5，-CTTCTATGCAGGGTCCAGCTAGA-3，(SEQ ID NO :l)Tm 值为 59°C反义引物1 :5，-GGAATGGCTTCTGATTTCCG-3，(SEQ ID NO :2)Tm 值为 58°C野生型探针5，-GGGTTAGCCCCGTGTATCTC-3，(SEQ ID NO 3) Tm 值为 68°C突变型探针5，-GGCTAGCCCCGTGTATCTCA-3，(SEQ ID NO :4)Tm 值为 68°C荧光定量PCR反应体系总体积为10 μ 1，包括DNA模板(20ng/ μ 1) 2 μ 1、10 μ M特 异性引物对(两条)各0. 225 μ 1、5 μ M特异性引物对(两条)各0. 1μ l、(5unit/l·! l)Taq DNA 聚合酶 0. 02 μ l、20mM dNTP 混合液 0. 1 μ l、25mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1、5X 荧光定量 PCR 反应缓冲液2 μ 1、去离子水4. 1 μ 1。在ABI 7900ΗΤ型荧光定量PCR仪是进行反应，反应条件为50°C 2 min,95°C lOmin，再进行40 55个PCR循环92°C 15s，60°C lmin。反应结束后在ABI 7900HT型荧
光定量PCR仪读取荧光量。步骤3 基因型分析采用ABI 7900HT 型荧光定量PCR仪自带软件 SDS (Sequence Detection Systems) V2. 3判读基因型，自动分析结果。被检测DNA的MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点 携带有T时，为肺癌易感型。本发明的应用实施例2 指导人们主动预防肺癌步骤1:DNA的提取对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写生活饮食习惯问 卷表。常规方法抽取被检测者EDTA抗凝血5ml。用硅胶吸附法提取血液标本的基因组DNA。步骤2 基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检测者DNA的MAPKAPK2基因上的rs4844550号 SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定该位点的基因型。步骤3 指导人们主动预防肺癌通过对被检测者基因型的分析，出具基因分型检测报告和对被检测者个体化健康 指导报告。基因分型检测报告详细说明了被检测者肺癌易感程度的高低以及患病概率大 小。个体化健康指导报告以被检测者的基因分型检测结果为基础，结合其生活饮食习惯问 卷调查结果，评估被检测这肺癌遗传易感的相对风险。同时制定出针对被检测者的个性化 健康行动方案，包括在饮食习惯、生活方式生活的改进建议等，并为被检测者普及预防肺癌 的健康知识。本发明的应用实施例3 指导临床判断肺癌预后步骤1 :DNA的提取对被检测的肺癌患者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，由临床医生 提供患者基本临床信息。在化疗前常规方法抽取被检测者EDTA抗凝血5ml。用硅胶吸附法 提取血液标本的基因组DNA。
步骤2 基因分型检测使用本发明提供的试剂盒，对被检测者DNA的MAPKAPK2基因上的rs4844550号 SNP位点进行荧光定量PCR检测，确定该位点的基因型。步骤3 指导人们主动预防肺癌通过对被检测者基因型的分析，出具基因分型检测报告和对被检测者个体化治疗 指导报告。基因分型检测报告详细说明了被检测肺癌患者预后的好坏以及生存概率大小。 个体化治疗指导报告以被检测者的基因分型检测结果为基础，结合其病理分型、分期等临 床信息，评估被检测检测肺癌患者的3年或5年生存概率。同时制定出针对被检测者个体 化治疗方案，包括是否手术、放化疗方案及剂量等。
权利要求
通过MAPKAPK2基因检测肺癌易感性和判断肺癌预后的试剂盒，其特征在于1)该试剂盒的物质包括检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水2)所述检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性引物对的序列包括有义引物序列和反义引物序列；所述检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性荧光探针对包括野生型探针序列和突变型探针序列；3)所述的特异性引物能特异性扩增出包含针对MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的DNA引物对和DNA探针对。
2.根据权利要求1所述的通过MAPKAPK2基因检测肺癌易感性和判断肺癌预后的试剂 盒，其特征在于试剂盒中供一人份使用的各成分的含量为DlOuM特异性引物对有义引物序列和反义引物序列各0. 225 μ 1，5 μ M特异性荧光探 针对野生型探针序列和突变型探针序列各0. 1 μ 1 ；2)5unit/ μ ITaq DNA 聚合酶 0. 02 μ 1 ；3)20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；4)25mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ；5)5Χ荧光定量PCR反应缓冲液2 μ 1 ；6)去离子水4.1μ 1。
3.根据权利要求1所述的通过ΜΑΡΚΑΡΚ2基因检测肺癌易感性和判断肺癌预后的试 剂盒，其特征在于所述检测ΜΑΡΚΑΡΚ2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性引物对的 序列如序列表SEQ ID N2 :1所示，有义引物序列的Tm值为59°C，反义引物序列的Tm值为 58°C;所述检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性荧光探针对的序列如序 列表SEQ ID N2 2所示，野生型探针序列的Tm值为68°C，突变型探针序列的Tm值为68°C。
4.根据权利要求1所述的通过MAPKAPK2基因检测肺癌易感性和判断肺癌预后的试剂 盒，其特征在于试剂盒的保存温度为-20°C。
5.通过MAPKAPK2基因检测肺癌易感性和判断肺癌预后的试剂盒的用途，其物征在于 用于检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的基因型。
全文摘要
本发明公开通过MAPKAPK2基因检测肺癌易感性和判断肺癌预后的试剂盒及其用途，其特征在于1)该试剂盒的物质包括检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；2)检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性引物对的序列包括有义引物序列和反义引物序列；所述检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的特异性荧光探针对包括野生型探针序列和突变型探针序列；3)特异性引物能特异性扩增出包含针对MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点的DNA引物对和DNA探针对。本发明通过检测MAPKAPK2基因上的rs4844550号SNP位点来检测个体肺癌的易感性，且还能用来评估肺癌患者的预后，可广泛应用于医疗研究。
文档编号G01N21/64GK101974637SQ20101053887
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月9日 优先权日2010年11月9日
发明者刘斌, 吕嘉春 申请人:广州医学院