亚锡荧光探头的制作方法
【技术领域】
[0001] 选择性螯合Sn2+的荧光探头。
【背景技术】
[0002] 将亚锡（Sn2+)加入到牙膏以防止牙斑和口腔疾病。发现Sn2+有效地抑制可造成人 体间隙牙斑内牙齿蛀蚀的某些细菌。近来，对Sn 2+的生物作用的关注渐增，因为锡是人体必 需的微量矿物质，并且以最大量存在于肾上腺、肝脏、大脑、脾脏和甲状腺中。存在一些证据 表明，锡涉及生长因子和防癌。缺锡可造成生长缓慢和听力损失，但是过量的锡积聚可不利 地影响呼吸和消化系统。然而，锡离子生理作用和抑菌机制的研究受限于缺乏可应用于活 细胞-真核或原核细胞的通用Sn 2+检测方法。
[0003] 需要在各种金属离子存在下对Sn2+具有高度选择性，并且在Sn2+螯合后显示出强 荧光性的化学探头。还需要用于活细胞的此类探头。还需要使背景噪音最小化，同时在Sn 2+ 存在于活细胞中的情况下，在所述细胞中提供一致的高荧光强度的探头。
[0004] 具有在细胞内Sn2+积聚中起作用的细胞器内的pH条件下正常工作的探头是有利 的。
[0005] 具有合成相对容易和简单的探头也是有利的。
[0006] 具有对生物细胞的毒性较低或至少使毒性最小化使得对于活细胞实施实验的探 头是有利的。
【发明内容】
[0007] 本发明通过令人惊奇地发现了 Sn2+荧光探头，解决了该需求，所述探头包含罗丹 明B衍生物部分作为荧光团，经由酰胺部分连接至肼基甲酸酯基团。此类探头化合物的用 途表现为用于监测活细胞中Sn 2+的成像探头，以研究Sn 2+在生物体系中的生理功能。考虑 到另外令人惊奇的发现，即在存在Sn浓度情况下溶酶体表现为细胞器，此类化合物是尤其 可用的。并且考虑到该细胞器相当酸性的微环境，与以另外方式经受低PH引发的荧光的其 它探头相比，本发明的探头表现出高荧光强度并且还使背景噪音最小化。换句话讲，考虑到 溶酶体的酸性，对比性探头导致不可取地引发荧光发射（从而产生背景噪音）。
[0008] 本发明的第一方面提供了具有下式（I)的化合物或其光学异构体或盐，所述光学 异构体为式（I)的非对映体或对映体：
[0009]
[0010] 其中R1为未取代的支化或未支化的C ^C12烷基、烯基、或炔基；并且其中R2、R3、R4、 R 5、R6、和R7各自独立地为氢或经基。
[0011] 在一个实施例中，R1为未取代的支化或未支化的C ^C1。烷基，优选C 烷基。在 另一个实施例中，&选自甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、戊基、和己基，优选异丁基。
[0012] 在一个实施例中，私、私、1?4、1?5、1?6、和1? 7各自独立地选自11、烷基、烯基、炔基、环烷 基、环烯基、芳基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂芳基，并且其中上述那些 可以是取代或未取代的。在另一个实施例中，R 2、R3、R4、R5、R6、和馬各自独立地选自H、C i-Ci。 烷基、烯基、或炔基，并且其中上述那些可以是取代或未取代的，优选未取代的。在另一个实 施例中，私和R 7为氢，和/或R 3、R4、R5、和R6各自独立地选自氢、或支化或未支化的C ^ C 5 烷基，优选未取代的(^至C 5烷基。在另一个实施例中，R 3、R4、R5、和R6各自独立地选自未取 代的(^至C 3烷基。
[0013] 本发明的另一个方面提供式（II)化合物或其光学异构体或盐，所述光学异构体 为式（I)的非对映体或对映体：
[0014]
[0015] 其中R1为未取代的支化或未支化的CfC12烷基或烯基。在一个实施例中，Ri为未 取代的C1-C1。烷基，优选地，R i为未取代的支化或未支化的C i-C；烷基。在另一个实施例中， 札选自甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、戊基、和己基，优选异丁基。
[0016] 在本发明的另一个方面中，提供了根据式（I)或（II)的化合物，其中所述化合物 选自：
[0017](a)叔丁氧基-酰胺，N-[3'，6' -双（二乙基氨基）-3-氧代螺[1H-异吲 哚-1，9'-[9H]咕吨]-H)-基]-;
[0018](b)叔丁氧基-酰胺，N-[3'，6' -双（二甲基氨基）-3-氧代螺[1H-异吲 哚-1，9'-[9H]咕吨]-2(3H)_ 基]-;
[0019](c)甲氧基_酰胺，N_[3'，6'-双（二乙基氨基）-3_氧代螺[1H-异B引 哚-1，9'-[9H]咕吨]-2(3H)_ 基]-;
[0020] ⑷乙氧基-酰胺，N-[3'，6' -双（二乙基氨基）-3-氧代螺[1H-异叼I 哚-1，9'-[9H]咕吨]-2(3H)_ 基]和
[0021] (e)甲氧基_酰胺，N_[3'，6' -双（二甲基氨基）-3_氧代螺[1H-异B引 哚-1，9'-[9H]咕吨]-2(3H)_ 基]和
[0022] (f)乙氧基-酰胺，N_[3'，6' -双（二甲基氨基）-3_氧代螺[1H-异B引 哚-1，9'- [9H]咕吨]-2 (3H)-基]_。
[0023] 在另一个实施例中，所述化合物选自：N-(3'，6'-双（二乙基氨基）-3_氧代螺 [异吲哚啉-1，9'-咕吨]-2-基）丙酰胺；N-(3'，6'-双（二乙基氨基）-3-氧代螺[异吲 哚啉-1，9'-咕吨]-2-基）丁酰胺；和N-(3'，6'-双（二乙基氨基）-3-氧代螺[异吲哚 啉-1，9' -咕吨]-2-基）戊酰胺。
[0024] 本发明的又一个方面提供了检测生物细胞中荧光的方法，所述方法包括以下步 骤：(a)用上述化合物（例如式⑴或式（II)化合物，或所述式⑴或（II)范围内的优选 或另选的化合物实施例）培养生物细胞；(b)用激发光照射所培养的细胞，优选地，其中所 述照射光具有至少520至580nm，或560nm的波长；并且（c)检测来自化合物的560至660nm 的光射线。在一个实施例中，所述方法还包括使所述生物细胞经受Sn 2+，另选地，其中所述 生物细胞选自口腔上皮细胞或链球菌（Streptococcus)属细菌，另选地，其中所述生物细 胞为任何真核细胞。在另一个实施例中，光发射检测位于真核细胞溶酶体细胞器中。在又 一个实施例中，用上文或本文先前所述的至少一种特定化合物实施所述方法。
【附图说明】
[0025] 提供了图1 _ 5。图I (a)和（c)为加入Sn2+后对照化合物Rl和本发明化合物R2 的荧光光谱；(b)和（d)分别为560nm激发的加入各种金属离子后化合物Rl和R2的荧光光 谱。化合物Rl为螺[1H-异吲哚-1，9'-[9H]咕吨]-3(2H)_酮，2-[2_[双（2-羟基乙基）氨 基]氨基]乙基]-3'，6'-双（二乙基氨基）。化合物R2为叔丁氧基-酰胺，N-[3'，6'-双 (二乙基氨基）-3-氧代螺[1H-异吲哚-1，9'-[9H]咕吨]-H)-基]_。
[0026] 图2a和2b分别示出对照化合物Rl和本发明化合物R2 (10 y M)的580nm荧光在 不同pH范围下的相关性。在560nm处激发。
[0027]图3a和3b为基于KB细胞（普遍存在的角蛋白形成肿瘤细胞系HeLa的亚系） CLSM(共聚焦激光扫描显微镜）图像衍生的简化示图。（al-cl)和（a2_c2)细胞分别用 10 yM对照化合物Rl和本发明化合物R2培养30分钟，然后（dl-fl)和（d2-f2)用50 yM 3必2进行培养30分钟。收集560 - 660nm的红色信道射线（bl、el、b2、e2) ;al、dl、a2、d2 分别为明视场图像，并且cl、fl、c2、f2分别为叠加图像（A ex = 543nm)。任何观察到的荧 光均是红色的。
[0028] 图4为对比共定位实验中基于KB细胞CLSM图像衍生的简化示图。（al-dl)细胞连 续用 50 y M SnF2、10 y M 对照化合物 Rl 和 I y M LysoTracker1'' Green DND 各自培养 30 分 钟；（a2-d2)连续用 50 y M SnF2、10 y M 本发明化合物 R2 和 I y M LfSOTracker? Green DND 各自培养30分钟。收集560 - 660nm(Aex = 543nm)的红色信道（bl，b2)或500-540nm (入ex = 488nm)的绿色信道的射线；al、a2分别为明视场图像，并且dl，d2分别为叠加图像。观 察到的荧光为：bl、b2中的红色；cl、c2中的绿色；以及dl、d2中的黄色。
[0029] 图5a和5b示出基于变异链球菌（Str印tococcus) (ATCCk700610?) CLSM图像 衍生的简化示图。示图未按比例绘制，而且为了进行示意性的说明进行了放大。（al-cl)和 (a2-c2)细胞分别用10 y M对照化合物Rl和本发明化合物R2培养30分钟，然后（dl-fl) 和（d2-f2)用50 yM 3必2进行培养30分钟。收集560 - 660nm的红色信道射线（bl、el、 b2、e2) ;al、dl、a2、d2分别为明视场图像，并且cl、fl、c2、f2分别为叠加图像Uex = 543nm)〇
【具体实施方式】
[0030]定义：
[0031] 就本发明目的而言，本文术语"烃基"定义为由碳原子和氢原子构成的任何有机单 元或部分。术语烃基中包括杂环。各种未取代的非杂环烃基单元的非限制性示例包括戊基、 3_乙基辛基、1，3_二甲基苯基、环己基、顺式_3_己基、7, 7_二甲基双环[2. 2. 1]-庚-1-基、 和萘-2-基。"烃基"定义中包括芳族（芳基）和非芳族碳环环。术语"杂环"包括芳族（杂 芳基）和非芳族杂环环。
[0032] 术语"取代的"用于整个说明书中。本文术语"取代的"定义为"涵盖可置换烃基 部分的一个氢原子、两个氢原子、或三个氢原子的部分或单元。取代的还可包括两个相邻 碳上氢原子的置换以形成新的部分或单元。"例如，需要单个氢原子置换的取代单元包括卤 素、羟基等。两个氢原子置换包括羰基、肟基等。相邻碳原子的两个氢原子置换包括环氧 基等。三个氢置换包括氰基等。环氧单元是需要置换相邻碳上氢原子的取代单元示例。术 语"取代的"用于本发明说明书中以表示，烃基部分，特别是芳族环、烷基链，可具有一个或 多个被取代基取代的氢原子。当部分被描述为"取代的"时，可置换任何数目的氢原子。例 如，4-羟基苯基为"取代的芳族碳环环"，（N，N-二甲基-5-氨基）辛基为"取代的