7' -二丁基-3'，6' -双（二乙基氨基）-3_氧代螺[异吲哚啉-1，9' -咕 吨]-2-基）氨基甲酸叔丁酯（化学式：C41H56N404)，（分子量：668. 91);
[0057] (11) (2'，7'-二甲基-3-氧代-3'，6'-二（哌啶-1-基）螺[异吲哚啉_1，9'_咕 吨]-2-基）氨基甲酸叔丁酯（化学式：C37H44N404)，（分子量：608. 77);
[0058] (12) (3-氧代-1'，2'，3'，4'，10'，11'，12'，13'-八氢螺[异吲哚啉-1,7'-吡喃 并[2,3-f:6,5-f']联喹啉]-2-基）氨基甲酸叔丁酯（化学式：C31H32N404)，（分子量： 524. 61)；
[0059] (13) (3-氧代-1'，2'，3'，4'，8'，9'，10'，11' -八氢螺[异吲哚啉-1，6' -吡喃 并[3,2-g:5,6-g']联喹啉]-2-基）氨基甲酸叔丁酯（化学式：C31H32N404)，（分子量： 524. 61)；
[0060] (14)N-(3'，6'-双（二乙基氨基）-3-氧代螺[异吲哚啉_1，9'_咕吨]-2-基）丙 酰胺（化学式：C31H36N403)，（分子量：512. 64);
[0061] (15)N-(3'，6'-双（二乙基氨基）-3-氧代螺[异吲哚啉_1，9'_咕吨]-2-基）丁 酰胺（化学式：C32H38N403)，（分子量：526. 67);和
[0062] (16)N-(3'，6'-双（二乙基氨基）-3_氧代螺[异吲哚啉_1，9'_咕吨]-2-基）戊 酰胺；（化学式：C33H40N403)，（分子量：540. 70)。
[0063] 金属离子感测:
[0064] 描述了金属离子感测方法。在去离子水中配制金属离子溶液（10.OmM)。各自配制 化合物Rl和R2 (0. 2mM)的乙醇原液，然后用乙醇-水（I:I，v/v，pH7. 04)稀释至20yM 以供光谱测量。对于滴定实验，将2.OmL化合物Rl和R2 (20yM)的溶液分别填充到Icm 光路长度的石英光学池中。经由微量吸移管将Sn2+原液逐渐加入到石英光学池中。加入 后5分钟，记录光谱数据。在选择性实验中，通过将适量的金属离子原液放入到2.OmLRU R2(20yM)溶液中，配制测试样品。对于荧光测试，在560nm处提供激发，同时收集565至 700nm的射线。
[0065] 描述了化合物Rl和R2的pH滴定。分别将化合物Rl和R2的原液加入到具有不 同pH的磷酸钠缓冲液中，至10yM最终浓度。采用560nm处的入ex，记录作为pH函数的荧 光发射光谱。根据580nm处的荧光发射强度对pH，绘制滴定曲线。
[0066]描述了细胞培养物的制备。KB细胞系由BiochemistryandCellBiology(China) 提供。细胞在37°C下生长于增补10%FBS(胎牛血清）和5%C02的MEM(改良伊格尔培 养基）中。将细胞（SXlOsL1)制片于18nm玻璃盖玻片上，并且使其附着24小时。通过自 BHI(Brain-HeartInfusion)琼脂板将单个菌落接种到5mLBHI液体培养基中并且在37°C 下培养48小时，制备变异链球菌（Streptococcus) ( 7〇〇610?)。
[0067] 描述了荧光成像。用OLYMPUS1X81激光扫描显微镜和60倍油浸物镜镜，进行共聚 焦荧光成像。显微镜配备有多条可见激光线（405、488、543nm)。图像用OlympusFV10-ASW 软件采集和处理。就细胞内Sn2+荧光成像而言：将包含0.2% (v/v)DMSO(二甲基亚砜）的 培养介质中的10yM化合物Rl或R2加入到细胞中。将细胞在37 °C下培养30分钟，并且用 PBS洗涤三次，以移除过量的探头，并且在PBS(2mL)中洗涤，然后成像。用PBS(2mLX3)洗 涤以移除过量探头后，用50yMSnF2*理细胞30分钟。用半导体激光器在543nm下实施 负载Rl或R2的细胞激发，并且收集560 - 660nm处的射线（单波道）。另选地，将培养介质 中的50yMSnF2加入到细胞中。将细胞在37°C下培养30分钟，并且用PBS洗涤三次，以移 除过量的SnF2。用PBS(2mLX3)洗涤以移除过量5必2后，用10yMRl或R2分别处理细胞 30分钟，并且用PBS洗涤三次，以移除过量的探头，并且在PBS(2mL)中洗涤，然后成像。然 后如前面一样实施细胞成像。
[0068] 描述了共定位实验。将培养介质中的50 y M SnF2加入到细胞中。将细胞在37°C下 培养30分钟，并且用PBS洗涤三次，以移除过量的SnF2。用PBS(2mLX3)洗涤以移除过量 3必2后，用10 y M化合物Rl或R2分别处理细胞30分钟，并且用PBS洗涤三次，以移除过量的 探头，并且在PBS (2mL)中洗涤，然后成像。然后如前面一样实施细胞成像。用PBS (2mLX 3) 洗涤以移除过量探头后，37°C下用LOyMLys〇TrackerK'Green DND处理细胞30分钟。然 后如前面一样实施细胞成像。
[0069] 描述了Sn2+在细菌中的荧光成像。分别在IOyM化合物Rl或R2的存在下，在37°C 下，在400rpm的分离筛上将刚稀释的变异链球菌（Streptococcus) (JTd?_ 7〇〇61〇?)接 种60分钟。然后通过以8,OOOrpm速率离心2分钟收集细菌，并且用盐水（pH= 7. 0)漂洗。 将所述过程重复三次，然后成像。用盐水（2mLX3)洗涤以移除过量探头后，在50iiMSnF2 存在下，在37°C下，在400rpm的分离筛上将细菌培养60分钟。然后通过以8,OOOrpm速率 离心2分钟收集细菌，并且用盐水（pH= 7. 0)漂洗。将所述过程重复三次，然后成像。光 源处于=543nm，提供激发，并且收集范围=560-660nm内的射线。
[0070] 描述了金属离子响应。荧光'打开'探头，有利于检测目标。化合物Rl或R2 (20iiM) 的乙醇-水（l:l，v/v，PH7.04)溶液是无荧光的。加入Sn2+(0-20eq)，580nm处的荧光打 开，并且由于Sn2+螯合引发的罗丹明开环反应，使得560nm激发下荧光显著增强（图Ia和 1C)。高度选择性对于优异的化学感应器而言是至关重要的。化合物Rl和R2在感测Sn2+ 方面显示出选择性。仅在Sn2+和Cr3+存在下，Rl和R2(20yM)的乙醇-水（1:1，v/v，PH 7. 04)溶液开启，同时其它过渡金属离子和重金属离子如K+、Ag+、Ca2+、Mg'Zn'Pb2+、Ni' Mn'Co'Cd'Hg2+在560nm激发下显示出最小的增强（图lb和Id)。Rl和R2的金属离 子响应适于检测活变异链球菌（Streptococcus)细胞中的Sn2+。
[0071] 图1(a)和（c)示出，加入0_20eq的Sn2+后，对照化合物Rl和本发明化合物 R2(20yM)的乙醇-水（l:l，V/v，pH7.04)溶液的荧光光谱。图1(b)和（d)示出在加入 各种金属离子（20.OXlO5M)后，化合物Rl和R2(2.OXlO5M)的乙醇-水（1:1，v/v，pH 7. 04)溶液在560nm激发下的荧光光谱。
[0072] 描述了pH值对荧光的影响。罗丹明衍生物的螺旋内酰胺（pirolactam)环在某些 pH范围内将打开，并且示出罗丹明的荧光。因此，需要检查化合物Rl和R2在具有不同pH 值的溶液中的荧光特性。此外，在细胞中，不同细胞器的酸度可显著不同。例如，溶酶体的 正常pH为4. 5-5. 5,这可引发Rl或R2开环。考虑到Sn2+探头Rl和R2细胞内或细胞外的 应用可受pH的干扰，通过在磷酸盐缓冲的盐水（PBS)中，用NaOH和HCl的水溶液调节pH， 实施酸-碱滴定实验（图2a和b)。滴定显示，引起化合物Rl或R2荧光打开的pH范围分 别为2. 5-6或2-4. 5。预计，Rl将由不存在Sn2+的细胞中的溶酶体开启。图2a和2b示出 PBS溶液中对照化合物Rl和本发明化合物R2 (10yM)在不同pH下的580nm荧光相关性。 在560nm处激发。
[0073] 描述了细胞内Sn2+荧光成像。通常将Sn2+加入到牙膏中，从而口腔上皮细胞最可 能接触Sn2+。KB细胞是通过荧光成像，在细胞水平上研究Sn2+分布的优秀候选物。本文研 究了Rl和R2作为Sn2+探头在活KB细胞荧光成像中的实际适用性。首先，在37°C下分别 用10yM化合物Rl或R2将KB细胞染色30分钟。如激光扫描共聚焦显微镜法所测，无Sn2+ 存在下，Rl在KB细胞位点中提供荧光发射（图3.bl) ;R2几乎不提供荧光（图3.b2)。该 结果与PH滴定实验相一致，即溶酶体酸性可引发Rl荧光发射。R2由于其较低的pH响应而 几乎不提供荧光。考虑到可使用R2的pH环境差异更大，随后的背景噪音更低，尤其是在更 酸性的环境如溶酶体中，这展示了R2相对于Rl的优异性。
[0074] 此外，当细胞在37°C下，在PBS中用化合物Rl或R2增补30分钟，然后在相同条 件下用50yMSn2+培养时，本发明化合物R2自某些细胞内区域提供显著的荧光增加（图 3.c2、f2)，而对照化合物Rl示出微弱的荧光强度变化（图3.cl，f1)。因此，细胞成像实验 表明，R2更适于在细胞水平下检测Sn2+。此外，Rl和R2可专门针对溶酶体，因为Rl和R2 带有与溶酶体目标锚定剂"二甲基乙基氨基"相类似的基团。
[0075] 图3a和3b示出基于KB细胞（al-cl)和（a2_c2)CLSM图像衍生的简化示图。细 胞分别用10yM化合物Rl和R2培养30分钟，然后（dl-fl)和（d2-f2)用50yM一啦进 行培养30分钟。收集560 - 660nm的红色信道射线（bl、el、b2、e2)毋1、(11、32、(12分别为 明视场图像，并且cl、fl、c2、f2分别为叠加图像（Aex = 543nm)。任何观察到的荧光为红 色的。
[0076] 图4示出对比共定位实验中基于KB细胞CLSM图像衍生的简化示图。首先，在 37°C下用50yMSn2+将KB细胞染色30分钟，然后在相同条件下，分别用10yM化合物Rl 和IyMEysoTracker?GreenDND或化合物R2 和IyMLysoTracker?GreenDND士咅养。 如激光扫描共聚焦显微镜法所测，Rl和R2在KB细胞位点中提供荧光发射（图4bI，b2)，其 非常好地与L:ys〇T