一种从兔抗人多抗中分离抗Fc抗体与抗P75、铰链区抗体的分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白分离纯化领域，更具体地，本发明涉及特定区域多克隆抗体的分 离纯化方法。
【背景技术】
[0002] 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性 结合，而这种结合在一定条件下又是可逆的，所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存 在液相中的相应抗体（或抗原）选择性的结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质 分开，达到分离提纯的目的。
[0003] 琼脂糖凝胶作为一种亲和层析的载体介质其优点是亲水性强，理化性质稳定，不 受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于〇. 05MO1/L时，对蛋白质 几乎没有非特异性吸附。
[0004] 当前，在制备重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白过程中，重组人II型 肿瘤坏死因子受体免疫的兔子的免疫血清经过亲和层析后获得的抗体蛋白往往是包含重 组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（以下简称抗FC抗体）、以及抗FC抗体的片段 基因（如抗P75、铰链区抗体）等的混合物，如何有效从多抗中分离出目标抗体仍是目前急 需解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明通过用环氧活化方法来制备可以分离兔抗人多抗中抗FC抗体与抗P75、铰 链区抗体的亲和层析填料，用亲和层析的方法来分离兔抗人多抗中抗FC抗体与抗P75、铰 链区抗体，从而完成本发明。具体地，
[0006] 发明公开一种含目的蛋白和非目的蛋白的混合物中分离纯化目的蛋白的方法， 其特征在于，所述混合物经过以非目的蛋白相关配基偶联填料填充的亲和层析柱进行亲和 层析。
[0007] 上述非目的蛋白相关配基包括但不限于：抗体、抗体融合蛋白、IgG、ScFv、Fab等， 优选单克隆抗体，最优选是以重组抗HER2人源化单克隆抗体为配基。
[0008] 上述目的蛋白包括但不限于：抗体或抗体融合蛋白，优选抗体融合蛋白，更优选重 组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白。
[0009] 优选地，上述目的蛋白是从免疫血清中获得或重组获得。
[0010] 发明还公开了一种从兔抗人多抗混合物中分离抗Fc抗体与抗P75、铰链区抗体的 分离纯化方法，其特征在于，所述兔抗人多抗经过以兔抗人多抗不相关配基偶联填料填充 的亲和层析柱进行亲和层析，使用pH酸性的柠檬酸洗脱抗FC抗体主峰并回收。优选地，所 述兔抗人多抗不相关配基是以重组抗HER2人源化单克隆抗体。更优选地，所述兔抗人多抗 不相关配基偶联填料通过以下方法制备：空白胶用水清洗去除乙醇后抽干，加入NaOH室温 处理lOmin后继续加入DMSO和甘油迷室温环氧活化6h，分别用纯乙醇和水清洗活化好的胶 后将胶和兔抗人多抗不相关配基偶联21h再用乙醇胺封闭过夜，最后用水和20 %乙醇清洗 封闭好的胶后保存在20 %的乙醇中。
[0011] 另外，发明公开了一种兔抗人多抗中抗FC抗体精纯方法，所述方法包括步骤：
[0012] A、填料的制备：空白胶用水清洗去除乙醇后抽干，加入NaOH室温处理lOmin后继 续加入DMS0和甘油迷室温环氧活化6h，分别用纯乙醇和水清洗活化好的胶后将胶平均分 成2份分别和兔抗人多抗相关配基、兔抗人多抗不相关配基偶联21h再用乙醇胺封闭过夜， 最后用水和20%乙醇清洗封闭好的胶后保存在20%的乙醇中。
[0013] B、非抗体蛋白的分离：重组人II型肿瘤坏死因子受体免疫后的兔血清过 rProteinA亲和层析，使用pH酸性的朽1檬酸来洗脱抗体蛋白主峰并回收。
[0014] C、兔血清中非抗目的抗体的分离：亲和层析柱填料为兔抗人多抗相关配基偶联填 料，上样样品为上述B中洗脱回收的抗体蛋白，使用pH酸性的柠檬酸来洗脱抗体蛋白主峰 并回收。
[0015] D、兔血清中抗FC区抗体和抗P75、铰链区抗体的分离：亲和层析柱填料为兔抗人 多抗不相关配基偶联填料，上样样品为上述C中洗脱回收的抗体蛋白，使用pH酸性的柠檬 酸来洗脱抗体蛋白主峰并回收，获得抗FC抗体。
[0016] 所述的兔抗人多抗相关配基是以重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白 为配基，兔抗人多抗不相关配基是以重组抗HER2人源化单克隆抗体为配基。
[0017] 通过上述方法，可有效把目的蛋白（如抗体融合蛋白）从含有其它非目的蛋白的 混合物中分离，尤其是从含抗Fc抗体和抗P75、铰链区抗体的兔抗人多抗中分离提纯抗Fc 抗体。
【附图说明】
[0018] 图1.非抗体蛋白的分离的亲和层析图谱；
[0019] 图2.兔血清中非抗目的抗体的分离的亲和层析图谱；
[0020] 图3.兔血清中抗FC区抗体和抗P75、铰链区抗体的分离的亲和层析图谱；
[0021] 图4.实施例的电泳图谱（图中，左图显示的是8%SDS-PAGE非还原电泳图谱， 右图显示的是 12%SDS-PAGE还原电泳图谱，M:Proteinmarker200kDal50kDa120kDa lOOkDa85kDa70kDa60kDa50kDa40kDa30kDa，l:样品重组人II型肿瘤坏死因子受体 融合蛋白免疫的兔血清，2 :层析柱1上样流出样品，3 :层析柱1洗脱主峰样品（层析柱2上 样），4 :层析柱2上样流出样品，5 :层析柱2洗脱主峰样品（层析柱3上样），6 :层析柱3上 样流出样品（抗P75和铰链区抗体），7:层析柱3洗脱主峰样品（抗FC区抗体），8:市售 重组人II型肿瘤坏死因子受体融合蛋白）；
[0022] 图5.实施例的ELISA分析图谱（图中，RS:兔抗重组人II型肿瘤坏死因子受体融 合蛋白多抗；Sample1:抗P75及铰链区抗体；Sample2:抗FC区抗体；Sample3:阴性对 照）。
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例仅仅对本发明进行进一步说明，不应理解为对本发明的任何限制。
[0024] 实例中重组人II型肿瘤坏死因子受体免疫的兔血清、重组人II型肿瘤坏死因子 受体-抗体融合蛋白和重组抗HER2人源化单克隆抗体蛋白均来自上海中信国健生物技术 研究院。
[0025] 实施例：重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（以下简称，抗FC抗体） 兔抗人多抗中抗FC抗体与抗P75、铰链区抗体的分离纯化。
[0026] 填料制备：空白胶（购自GE公司）用水清洗去除乙醇后抽干，加入NaOH室温处理 lOmin后继续加入二甲基亚砜（DMS0)和甘油迷室温环氧活化6h，分别用纯乙醇和水清洗活 化好的胶后将胶平均分成2份分别和重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（来 自上海中信国健生物技术研究院，以下同）、重组抗HER2人源化单克隆抗体蛋白（来自上海 中信国健生物技术研究院，以下同）偶联21h再用乙醇胺封闭过夜，最后用水和20%乙醇清 洗封闭好的胶后保存在20%的乙醇中。
[0027] 层析柱 1 :XK16/20,rProteinA，1CV= 20ml，H= 10cm，flow= 2ml/min
[0028] 层析柱2 :XK16/20,重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白为配基偶联， 1CV = 7ml, Η = 3. 5cm, flow = 1. 4ml/min
[0029] 层析柱3 :XK16/20,重组抗HER2人源化单克隆抗体蛋白为配基偶联，1CV= 7ml，H =3. 5cm,flow= 1. 4ml/min
[0030] 层析系统：AKTA-PURIFIER
[0031] 操作系统：UNIC0RN5. 20系统
[0032] 样品：重组人II型肿瘤坏死因子受体免疫的兔血清（来自上海中信国健生物技术 研究院，以下同）。
[0033] 1、非抗体蛋白的分离：填料为rProteinA
[0034] 溶液：
[0035] A平衡buffer20mMPB+150mMNacLρΗ7· 0 冰浴
[0036] Β洗脱buffer 25mm梓檬酸缓冲液 pH: 3 冰浴
[0037] 操作流程：
[0038] 取层析柱1，上样为免疫兔血清：平衡buffer= 1 :5混合的混合液，pH7. 0±0. 1。
[0039]