一种肝癌组织中fgfr3的新型剪接变异体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种肝癌组织中FGFR3的新型剪接变异体及 其应用。
【背景技术】
[0002] 慢性肝脏疾病是危害我国人民健康的重大公共卫生问题之一，在我国导致死亡的 主要原因中占第六位，人群中己型肝炎病毒皿V携带率为9. 09%，其中慢性己型肝炎患者 约5000万，肝脏炎症的反复发作导致10%~20%的患者发展为肝硬化，其中10%~15% 的肝硬化患者最终发展为肝细胞肝癌。除了肝癌的危害W外，肝炎一肝硬化一肝癌的转化 过程中的各个阶段都会对患者的健康和生命造成严重危害，对我国产生了沉重的经济负担 和社会问题。目前有关己型肝炎一肝硬化一肝癌病变机制的研究主要包括己肝易感因素的 研究、疫苗保护效率和失败原因、慢己肝抗病毒治疗反应的宿主细胞的反应、导致肝纤维化 和肝硬化进展的宿主因素、肝癌发生发展的遗传及环境因素等。在临床诊断和治疗方面，我 国目前尚缺乏有效、特异、具有指导性意义的分子标识物，W及相应的诊断、治疗及其预后 检测手段，尤其在特异性药物的研究方面更是严重地滞后。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是克服上述缺点，提供一种肝癌组织中FGFR3的新型剪接变异体及 其应用，该新型变异体可促进肝癌细胞增殖和转移，表明该新型变异体能作为肝癌的诊断 标志物。
[0004] 本发明的技术方案是：
[0005] 一种肝癌组织中FGFR3的新型剪接变异体，所述新型剪接变异体为FGFR3A7 所 述FGFR3&7 9的基因序列为：
[0006] CGCTGGACGTGCTGGCCGAGGAGGAGCTGG。
[0007] 进一步地，所述FGFR3&7e是将肝癌组织RNA逆转录后的产物经过巢式PCR扩增反 应得到。
[000引进一步地，所述巢式PCR扩增反应包括外侧引物和内侧引物两对PCR引 物，所述外侧引物的上游引物序列为；5' -CGTCGTGGAGAACAAGTTTGG-3'，所述外 侧引物的下游引物序列为；5' -GGAAGCGGGAGATCTTGTG-3';所述内侧引物的上游 引物序列为；5' -AGCATCCGGCAGACGTACAC-3'，所述内侧引物的下游引物序列为 5' -GCCACCACCAGGATGAACAG-3'。
[000引一种上述新型剪接变异体FGFR3&7e的巢式PCR引物，所述巢 式PCR引物包括外侧引物和内侧引物两对PCR引物，所述外侧引物的上 游引物序列为；5' -CGTCGTGGAGAACAAGTTTGG-3'，所述外侧引物的下游引 物序列为；5' -GGAAGCGGGAGATCTTGTG-3';所述内侧引物的上游引物序 列为；5' -AGCATCCGGCAGACGTACAC-3'，所述内侧引物的下游引物序列为 5' -GCCACCACCAGGATGAACAG-3'。
[0010] 新型剪接变异体FGFR3&7g在制备肝癌的诊断标志物中的应用。
[0011] 本发明通过将肝癌组织中提取出的RNA进行逆转录，逆转录的产物进行巢式PCR 扩增反应处理，得到FGFR3的新型剪接变异体FGFR3&7e;通过实验显示，新型剪接变异体 FGFR3&7e可促进肝癌细胞增殖和转移，并能促进裸鼠皮下肝癌细胞移植瘤的生长，该实验 结果表明FGFR3&7g可作为肝癌的诊断标志物，因此，检测肝癌患者组织中是否存在剪接变 异体FGFR3&7 9对判断肝癌的预后有着较高的指导意义。
【附图说明】
[0012] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用 的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本 领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可W根据送些附图获得其他 的附图。
[0013] 图1是本发明扩增产物凝胶电泳图；
[0014] 图2是本发明中PCR扩增产物的测序图；
[001 引 图 3 是本发明中稳定表达FGFR3"ic，FGFR3&79和FGFR3AT-iHepG2/SMMC-7721 细胞 的CCK-8细胞增殖试验图；
[0016] 图4是本发明中FGFR3&7 9促进化PG2/SMMC-7721细胞迁移能力的表示图；
[0017] 图5是本发明中FGFR3&7 9对肿瘤生长的影响的表示图；
[001引图6是本发明中FGFR3&7 9对肝癌细胞裸鼠体内肺转移的影响的表示图。
【具体实施方式】
[0019] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0020]1、肝癌组织中RNA抽提
[0021] 采用化izol试剂抽提，具体步骤如下：
[0022] (1)从-7(TC中冰箱中取出临床肝癌组织标本等正常对照标本块，取出50mg加入 曾在Depc水浸泡并高温高压过的玻璃匀浆器中，迅速往匀浆器中加入ImlTrizol试剂，手 动研磨，所有操作都要在冰上，每例标本研磨时间控制在6minW内；
[002引 似研磨后将匀浆器中的所有液体转移到1. 5mlEP管中，冰上静置5min;
[0024] (3)加入0. 2ml氯仿（每ImlTrizol试剂），剧烈振荡混合15s;
[00幼 （4)室温下静置3min;
[002引 妨12, 000g，4°C离必15min，小必吸取上清液；
[0027] (6)加入异丙醇0. 5ml(每ImlTrizol试剂），颠倒混匀；
[002引 （7)室温下静置IOmin;
[0029] 做 12,OOOg, 4°C离必IOmin;
[0030] (9)见管底白色RNA沉淀，弃上清液，加入lml75%己醇-DEPC溶液洗涂；
[0031] (10)7, 500g，4°C离必 5min;
[003引（11)弃去己醇，干燥RNA沉淀，约5-lOmin;
[0033] (12)DEPC-H2O溶解RNA，紫外分光光度仪测定RNA浓度；
[0034] (13)调整RNA浓度至 0. 5Ug/U1。
[00对2、逆转录
[0036]采用ReverseTranscriptionSystem(美国Promega公司），具体操作如下：
[0037] (1)冰上融解RNA,在室温下融解RTBuffer,RNase-freewater;
[003引似冰上建立逆转录反应体系20U1:
[0039] 八：DKPC-I似） 8. 9 1-1 1 RNA (1Ug/U1) 1 口 1 B:: IQX 脚BWfer 2 P l
[0040] dNTP (IOmM) 2 Ii 1 M典12 (化nM) 4 Wl Oligo (dT) 15 动物（化岛H宮/ U 1) 1 1x1 Rnasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 P1 AMV 逆转录酶（20u/ U 1) 0.6 P l 总体积 細W 1
[00川（3)PCR仪上进行逆转录反应，两步法，按照W下条件处理：
[0042] A：70°C,IOmin；4°C,IOmin；
[0043]B加入处理过的A中混匀；42°C，15min;95°C，5min;4°C，保存；
[0044] 反应后获得逆转录产物即cDNA，于-20°C保存，准备进行RT-nestPCR。
[004引3、巢式PCR扩增反应
[0046]巢式PCR(nestedPCR)，是指利用两套PCR引物（巢式引物）对进行两轮PCR扩 增反应。在第一轮扩增中，外引物用W产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第 二轮扩增。巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个祀位点的可能性（因为与 两套引物都互补的引物很少）增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配 对，增加了检测的可靠性。由于研究发现FGFR3在肝癌组织及细胞中表达量较低，所W使用 RT-nestPCR进行扩增，我们利用01igo6. 0自行设计引物两对FGFR3(F1) -FGFR3巧1)、 FGFR3 (F2) -FGFR3巧2)，其中前者为外侧特异引物，后者为内侧特异引物，它们横跨FGFR3 外显子6至外显子10,我们用外侧引物合成的PCR产物作为模板，W内侧引物为引物进行二 次巢氏PCR扩增，我们使用Promega的高效GotaqDNA聚合酶建立25U1RT-nestPCR体 系，详细步骤过程反应条件如下：
[0047] 牌―nest P嫌IRT- nest PCR I condition: 10XBuf:f'er: 5 U I Step I: 94° C--5min MgCU: 3 HlStop2: 94。C--30s 10 mM dNTP: 0. Sn I Step 3: 60。C--30s 12. 5 uM primerCFU : 0. 5 P I Step 4: 72° C--45s 12. 5 PM prl阻er'(反i) : O',技'ul StepS: turn to Step2, 28 cycles. Taq: 0.1 I Step 6: 72° C -'-IQmin (ldHoO: 14. 4 U I btep 7: 4° C 5niin cDNA: Iul
[0048] total volura 25 P I
[0049] 脚-賊P雄2::' RT- nest PGR2condition: IOXBuffer: Swl Step 1：: 94° --5min MgCL：. 3 Ul Step 2: 94。C--30s 10nilclMP: 0.r)y.ISt叩 3: 60。C--30s 12:. 5 H M primer (F2) : 0. 5 U I Step 4: 72° C--45s 12.5 U M primer (R2) : 6.日u I Step己：turn to Step2, 28 cycles Taq: 0.1 U I Step 6: 72。C--IOmin d地20: I生.4 U I Step 7: 4° C--:反min cDNA: I til totalVOIUiIi25yI
[0050] 其中，FGFR3巢式PCR引物序列为：
[0051] 外侧引物的上游引物FGFR3 (Fl)
[0052] 外侧引物的下游引物FGFR3巧1)
[0053] 内侧引物的上游引物FGFR3 (F2)
[0054] 内侧引物的下游引物FGFR3巧2)
[0055] 4、扩增产物凝胶电泳后行目的基因切胶回收
[0056] (1)扩增产物凝胶电泳：
[0057] 曰、准确称取琼脂糖0.Sg;
[0058] b、将琼脂糖溶于40ml1XTAE溶液，微波炉加热至沸腾，使琼脂糖完全溶解；
[0059] C、上述溶液冷却至6(TC时，加入1. 5y1EB，混匀后倒入准备好的凹槽中，插入上 样孔梳子，待其自然冷却；
[0060] d、拔出梳子，将凹槽置入电泳槽，1XTAE溶液作为电泳缓冲液。每孔加入PCR产物 20U1+上样缓冲液1U1，IOOV电压下电泳30min;
[0061]e、将溶解后的凝胶移入QIAquickspin柱，13, 000巧