一种转化合成2-pe的酵母静息细胞及制备和高收率转化合成2-pe的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属生物化工合成2-PE技术领域，具体涉及一种用酵母静息细胞转化合成 2-PE的方法。本发明所述酵母静息细胞于2015年6月19日保藏于位于中国武汉武汉大 学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO :M 2015389,保藏物名称为：酿酒酵母 SH003, Saccharomyces cerevisiae SH003〇
【背景技术】
[0002] β -苯乙醇（β -phenylethanol，2-PE)亦称2-苯乙醇，因具有柔和、愉快而持久的 玫瑰香气而广泛用于食品、烟草和日化产品中。天然2-PE是从玫瑰精油中提取获得，受到 植物原料等因素影响，无法进行大规模工业生产且价格昂贵。利用微生物转化法可以取代 从植物精油中生产2-PE。目前主要是通过添加前体物质L-苯丙氨酸（L-Phe)来微生物转 化合成2-PE，酵母细胞通过艾氏途径（Ehrlich pathway)，即L-Phe通过转氨作用生成苯丙 酮酸，再脱羧形成苯乙醛后，在脱氢酶的作用下生成2-PE。酵母细胞在自身生长代谢过程 中会产生大量的乙醇，乙醇和2-PE浓度过高又抑制酵母细胞的转化作用，是生物转化法生 产2-PE产率低下的主要原因，也是制约生物法生产天然2-PE的技术关键。酵母细胞转化 L-Phe生产2-PE时，当反应液中2-PE浓度达到2g/L时，可抑制大部分酵母细胞的生长，当 反应液中2-PE浓度达到4g/L时，是酵母细胞转化合成的极限值。采用水/有机溶剂两相 体系进行产物原位转移（ISPR)技术可一定程度解决生物催化过程中的产物抑制效应，但 后续分离纯化步骤繁杂，提取精制收率低。利用树脂吸附的ISPR技术亦可提高2-PE产量， 但在实际操作过程中容易染菌而使其应用受到限制。采用生长细胞转化合成2-PE过程中， 由于生长细胞培养基中含大量糖、蛋白粉、酵母粉等有机物，在糖酵解过程中会产生大量乙 醇、杂醇(丁醇）和杂酸(丁酸和异丁酸等）等副产物，有机物、杂酸、杂醇的存在会降低产品 品质，并使后续分离纯化困难。
[0003] 针对现有转化合成技术存在的问题和技术难点，我们采用酵母静息细胞以整体细 胞作为反应催化剂，可以有效地控制反应液的组成，同时减少了培养基成分对转化过程的 影响，反应液组分简单、副产物少、无需在无菌条件下操作、产品易于分离纯化、细胞可重复 利用，且在转化过程中不必担心底物、产物及有毒副产物对细胞生长的影响。目前在各个领 域的已展开了静息细胞研究，如天然化合物的生物合成、药物前体化合物转化、乳酸、乙酸 的生产等领域。但到目前为止，国内外还未见到采用静息细胞转化合成2-PE的相关报道。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种制备2-PE的酵母静息细胞及其制备方法。 本发明要解决的另一个问题是提供一种使用酵母静息细胞高收率、高纯度制备2-PE的方 法。
[0005] 本发明通过以下技术方案解决上述技术问题： 一种转化合成2-PE的酵母静息细胞，中文命名：酿酒酵母SH003,英文命名： cereKisiae SH003,于2015年6月19日保藏于位于中国?武汉?武汉大 学的中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号CCTCC NO:M 2015389。
[0006] -种转化合成2-PE的酵母静息细胞的制备方法，其步骤包括： (1) 从斜面培养基挑取1~2环菌苔至30mL细胞增殖培养液中，于28°C、180r/min振 荡培养18-24h ; (2) 再以2%的接种量接种于细胞增殖培养液中，于500mL三角瓶中装100mL细胞增殖 培养液，于28°C、180r/min振荡培养24h，进行细胞扩增培养； (3) 再进行离心收集菌体细胞，离心转速5000r/min，离心5-10min，弃上清，收集菌体； (4) 用pH值为6. 0-6. 8、浓度为0. lmol/L的磷酸钠缓冲液离心洗涤细胞两次； (5) 再将菌体重悬于pH值为5. 1-5. 5、浓度为0. 1 mol/L的磷酸钾缓冲液中，配制酵母 静息细胞浓度为8-12%(w/w)的菌悬液，于4°C冰箱中保存备用。
[0007] 为了获得更好的技术效果，上述培养酵母细胞的斜面培养基组分：葡萄糖20g/L， 蛋白胨3 g/L，酵母粉2 g/L，麦芽汁2 g/L;上述细胞增殖培养液组分：葡萄糖30 g/L，蛋 白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，麦芽汁3 g/L，pH值为5. 8~6. 2;步骤（4)中所述酵母静息细 胞浓度为8-12%(w/w)的菌悬液保存有效期不少于90天。
[0008] 本发明还包括一种使用酵母静息细胞高收率转化合成2-PE的方法，其步骤为： (1) 取酵母静息细胞浓度为8-12%(w/w)的菌悬液30mL于250mL的三角瓶中； (2) 向菌悬液中加入0. 15-0. 60g的底物L-Phe和0. 3-0. 9g的辅助底物； (3) 再向混合液中加入促进转化合成的溶液A和溶液B，其中溶液A添加量20-100uL， 溶液B添加量20-100uL ; (4) 将混合液置于25-30°C下，100-200r/min振荡反应16-48h ;反应结束后，离心转速 3500-5000r/min，离心5-lOmin，上清液中即含制备的2-PE。
[0009] 作为优化，步骤（3)中，溶液 A 含有 0· 4-1. Omol/L 的 Mg2+和 0· 2-1. Omol/L 的 Zn2+， 溶液B含有0· 1-0. 5mol/L的维生素队和1. 0-2. 0mol/L的α -酮戊二酸； 作为优化，步骤（1)中，在混合液中加入占混合液质量10%(W/W)的大孔树脂，所述大孔 树脂为ΗΖ816大孔吸附型树脂，其湿视密度为0. 65-0. 75g/mL，范围粒度为0. 315-1. 25mm， 该树脂对产物2-PE吸附容量高，对底物L-Phe基本无吸附作用；步骤（4)中，转化反应结束 后，真空抽滤分离混合液与大孔树脂，大孔树脂用纯水洗净后浸泡于8-10倍大孔树脂体积 的乙醇中进行产物洗脱；洗脱液减压蒸馏去除乙醇，得高纯度2-PE产品； 作为优化，步骤（4)后，混合液于10000r/min离心10min，取上清液，所述上清液通过大 孔树脂柱，过柱流速为0. 5-2. Om3/ (m3 · h)，再用5-7倍树脂体积的乙醇洗脱产物，洗脱流 速为1. 0-3. 5m3/ (m3 · h)，收集乙醇洗脱液；洗脱液减压蒸馏去除乙醇，得2-PE产品；所述 大孔树脂为HZ816大孔树脂，其湿视密度为0. 65-0. 75g/mL，范围粒度为0. 315-1. 25mm，该 树脂对产物2-PE吸附容量高，对底物L-Phe基本无吸附作用； 作为优化，所述辅助底物为乙醇、D-甘露糖、蔗糖、葡萄糖中的一种； 作为优化，所述辅助底物优选为乙醇； 作为优化，步骤（4)中离心分离后获得的稀湿菌体用pH值为6. 8、浓度为0. lmol/L的 磷酸钠缓冲液常温离心洗涤两次，离心转速5000r/min离心10min ;再将菌体重悬于pH值 为5. 1、浓度为0. lmol/L的磷酸钾中，配制酵母静息细胞浓度为8-12% (w/w)的菌悬液；再 按步骤（1) - (4)所述方法重复使用合成2-PE ;重复次数不少于8次。
[0010] 本发明的特点在于采用酵母静息细胞生产2-PE，细胞可重复利用，不需要在无菌 条件下进行操作，反应液组分简单，采用乙醇作为辅助底物，对产物的分离纯化不造成影 响，利用树脂原位吸附产物不仅可提高转化合成2-PE产量，还可与提取工艺耦合，所生产 的2-PE产品香味纯正。溶剂乙醇可回收利用，主要的废水排放为增殖培养液上清液，及设 备清洗水，可生化性强。与酵母细胞生长细胞生物转化2-PE的工艺相比，具有生长周期短， 易于提取，操作简便，成本低，环境污染小等优点，有较大的工业化应用