一种抑制黄瓜黑星病菌生长的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系， 更具体的说，是探索化合物对黄瓜黑星病菌的抑菌和杀菌活性。
【背景技术】
[0002] 黄瓜是萌芦科黄瓜属中的一个种，一年生攀援性草本植物，别名胡瓜，染色体数 2n=2x=14。黄瓜是我国乃至全世界的重要蔬菜作物。据联合国粮农组织的数据统计，2008 年全球黄瓜的收获面积为263. 50万公顷，其中中国的收获面积达到170. 28万公顷，占全世 界的64%，居世界第一。
[0003] 黄瓜起源于喜马拉雅山南麓的印度北部、锡金、尼泊尔和中国的云南地区。黄瓜在 公元前100年传入中国，于九世纪传入法国，十六世纪中叶传入北美，到公元1600年前后， 黄瓜已被传播到世界各地。黄瓜在自然选择和人工栽培驯化的过程中，形成了丰富多样的 黄瓜类型和品种，如欧洲温室型黄瓜，欧美露地栽培型黄瓜，中国华北型黄瓜，中国华南型 黄瓜，加工型黄瓜等。目前，我国国家农作物种质资源长期库和国家蔬菜种质资源中期库中 分别保存了黄瓜种质资源1521份，其中来源于我国国内的黄瓜种质共1462份，占保存总份 数的96%，分别为来源于全国29个省、市、自治区（包括台湾）的地方品种和育成常规品种。 其中山东省215份，河北省115份，辽宁省98份，分列前三位。
[0004] 黄瓜黑星病是一种世界性病害，给黄瓜生产带来了巨大的损失。1889年，Arthur 首次报道了黄瓜瓜条上受黑星病侵害情况。黑星病在黄瓜的整个生育期均可发病，可危害 茎、叶及果实，并可致瓜条畸形、"冒油"，失去商品价值。该病害曾在欧洲、北美与东南亚等 地区严重威胁黄瓜生产。20世纪50~60年代美国、荷兰等国曾发生了黑星病的大流行。我 国于1950年在河南省的瓠瓜上首先发现了该病菌，1966年和1979年分别在吉林省和黑龙 江省牡丹江市的黄瓜生产上发现了这种病害，但均未造成大面积灾害。80年代以来，黄瓜黑 星病首先在黑龙江、吉林、辽宁三省大面积流行，造成了较大的经济损失。1983~1985年丹 东市保护地黄瓜黑星病的病株率达65%，重病区的病株率在90%以上，减产73%，病害发生较 轻的地区减产约20%。吉林省浑江市露地主栽黄瓜品种津研二号在黑星病区的枯死株率达 53%，病瓜率高达100%。在大棚栽培的津研六号黄瓜品种，病株率达100%，病瓜率达90%以 上。据调查，在黄瓜黑星病病区，病株率在90%以上，发生严重的地区减产可达50~70%。由 此可见，黑星病一旦爆发，将给黄瓜生产造成非常严重的危害。
[0005] 黄瓜黑星病的病原为真菌半知菌亚门瓜疮痂枝孢霉，菌落初为白色，以后颜色逐 渐变深呈灰色，中央灰黑，略带绿色，呈不规则形或圆形，平铺状，外围为白色菌丝。菌丝体 颜色从无色到淡褐色，有时被茸毛，有隔，分生孢子梗细长，单生或丛生，直立或略弯，顶端 有分枝，分枝末端钝，有时基部膨大，淡褐色至深褐色或榄褐色。分生孢子椭圆形或不规则 形，多数单胞，少数具隔，淡褐色，单胞，少数双胞。
[0006] 黑星病在黄瓜感病品种的整个生育期均可发病，叶片、茎、卷须、瓜条及生长点等 部位均可受害，以嫩叶、嫩茎、幼果受害最为严重，而老叶和老瓜不敏感。幼苗受害，子叶上 产生黄白色圆形斑点，扩展后子叶腐烂，严重时心叶枯萎，全株死亡。叶片发病时，最初为褪 绿的近圆形小斑点，扩展后呈直径2~5mm近圆形斑，后期病斑干枯后穿孔，边缘呈星纹状。 瓜条感染黑星病时，起初为圆形或椭圆形褪绿小斑，病斑处有胶状物溢出，后变为琥珀色， 俗称"冒油"。病斑处的组织生长受到抑制，使瓜条畸形。黄瓜的茎蔓、卷须、叶柄也会受黑 星病侵染，变褐腐烂。
[0007] 病原菌是通过各种致病因子对寄主超微结构的影响来实现对寄主的破坏的。细胞 壁降解酶和毒素是黄瓜黑星病菌在侵染黄瓜过程中重要的致病因子。
[0008] 黑星病菌在侵染黄瓜植株的过程中会产生一系列的酶，并以此来实现对寄主的影 响。由瓜枝孢霉分泌的果胶酶和半乳糖醛酸酶在细胞壁的降解中起主要作用，并以此来获 得碳源营养，同时真菌纤维素酶也在分解寄主细胞组织中扮演重要角色。从黄瓜黑星病菌 的培养滤液中纯化得到一种果胶酶，这种果胶酶能够引起黄瓜下胚轴的木质化作用。用病 菌接种感病品种，发病过程中果胶酶的活性增加。认为黑星病菌侵染黄瓜后首先是果胶酶 起作用，然后是纤维素酶起作用。
【发明内容】
[0009] 本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对黄瓜黑星病菌的生物活性。
[0010] 本发明的具体技术方案如下： 本发明的创新点是发现化合物对黄瓜黑星病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测量得到 其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
[0011] 所述化合物结构特征如下图式所示：
【具体实施方式】
[0012] 下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明范围。
[0013] 实施实例1 测量最小抑菌浓度MIC值。
[0014] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0015] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0016] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0017] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50μL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
[0018] 计算公式为：菌液浓度=nX20X100cfu/mL (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0019] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小抑菌浓度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC为最小抑菌浓度，即药物 与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
[0020] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同浓度的药液和100yL 菌液，使最终菌液浓度为1~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第 12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物最 低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。
[0021] 测得最小抑菌浓度MIC值为16μg/mL。
[0022] 实施实例2 测量最小杀菌浓度MBC值。
[0023] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0024] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0025] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0026] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50μL，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓 度=nX20X100cfu/mL。
[0027] ( 5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0028] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小杀菌浓度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基础上，从每管吸取 10μL溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度 为最小杀菌浓度(菌落数小于等于5)。
[0029] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同浓度的药液和100yL 菌液，使最终菌液浓度为l~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照， 第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物 最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取 10μL接种于营养琼脂平板上，做好标记，于28°C培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓 度记为该药的MBC，每个实验重复三次。
[0030] 测得最小杀菌浓度MBC值为64μg/mL。
【主权项】
1. 一种抑制黄瓜黑星病菌生长的化合物，其特征在于： (1) 结构特征如下图式所示：(2) 其可作为黄瓜黑星病菌的抑制剂和杀菌剂； (3) 其对黄瓜黑星病菌的最小抑菌浓度MIC值为16 μ g/mL ; (4) 其对黄瓜黑星病菌的最小杀菌浓度MBC值为64 μ g/mL。
【专利摘要】本发明发现对黄瓜黑星病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其黄瓜黑星病菌的最小抑菌浓度MIC值为16μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为64μg/mL。
【IPC分类】A01P3/00, C07D413/04
【公开号】CN105330655
【申请号】CN201510723797
【发明人】不公告发明人
【申请人】许自协
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月1日