一种类贝壳珍珠层重组蛋白CSCa及其调控制备碳酸钙的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于材料制备领域，具体涉及一种类贝壳珍珠层重组蛋白CSCa及其调控制 备碳酸钙的方法。
【背景技术】
[0002] 贝壳珍珠层作为一种典型的天然生物矿化材料，其构成含有令人类佩服的特殊组 装方式，因而具有高强度、强韧性等优异的机械性能。贝壳珍珠层最突出的力学性能就是它 的高韧性，大约是天然文石的3000倍，这主要是由于有机基质在贝壳力学性能设计中起到 了重要作用。究其根本原因，是生物体利用其自身对于材料构筑中的强大控制能力，通过细 胞的调制作用，在无机矿物内或者矿物晶体间有规律地嵌入生物高分子。虽然其比例很小， 但从根本上改变了材料的断裂韧性，从而大大提高了韧性。自然界生物材料的这种形成过 程与组成、结构机理，对于现代材料的设计和制备是一个重要的启发。
[0003] 生物矿化包含着多种蛋白和有机质大分子的相互作用，这些蛋白质或有机质分子 在初始成核或稳定矿化形貌上起着模板的作用。近年来，已经有科学家们研究了单种蛋白 调控矿物材料的合成方法。比如，Dodenhof等人研究了剪接变体在指导碳酸钙矿化中的作 用、Bram研究了 PAH在碳酸钙形貌上的作用等。然而，单一蛋白在矿化的特定阶段是有限的。 我们根据基因和蛋白质组学知道，在生物矿化过程中，许多基因和蛋白是相互作用的。因 此，将具有不同功能的多种蛋白组合起来，构建一个重组蛋白，也许是合成制备材料的一种 新方法。
[0004] 碳酸钙作为一种广泛存在于自然界的生物矿物，已经受到了来自生物矿化领域众 多科学家的关注。自然界中有6种碳酸钙矿物具有相同的成分但不同的结构：方解石 (calcite)，文石（aragonite)，球文石（vaterite)，一水合碳酸^(monohydrocalcite)，六 水合碳酸I^Khexahydrate-kaite)和无定型碳酸|丐(amorphous calcium carbonate)。在这 些同素异构体中，方解石、文石和球文石均可作为生物矿物沉淀析出。碳酸钙生物矿物的沉 积首先是预成核簇的形成，然后这些预成核簇聚集导致溶液中无定型纳米颗粒成核，随后 这些纳米粒子在模板上自组装，在到达临界尺寸之后，形成可以被模板特异性选择的某种 晶体结构。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种类贝壳珍珠层重组蛋白CSCa及其 调控制备碳酸钙的方法。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种类贝壳珍珠层重组蛋白CSCa，由几丁质结合区域、蚕丝蛋白重复序列和钙离 子结合区域组成，所述几丁质结合区域的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述蚕丝蛋白重 复序列的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；所述钙离子结合区域的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0008] 编码上述类贝壳珍珠层重组蛋白CSCa的基因，由几丁质结合区域、蚕丝蛋白重复 序列和钙离子结合区域组成，所述几丁质结合区域的碱基序列如SEQ ID N0.4所示;所述蚕 丝蛋白重复序列的碱基序列如SEQ ID N0.5所示；所述钙离子结合区域的碱基序列如SEQ ID N0.6所示。
[0009] 上述类贝壳珍珠层重组蛋白CSCa调控制备碳酸钙的方法，包括如下步骤：
[0010] (1)重组蛋白CSCa溶液的制备：构建含有几丁质结合区域、蚕丝蛋白重复序列和钙 离子结合区域的重组质粒，将重组质粒转化到感受态细胞中，扩大培养菌体并诱导其表达 重组蛋白CSCa;收集菌体，高压破碎后取上清，上清过柱与柱中的几丁质结合，随后经洗杂、 洗脱、透析处理后，获得纯化的重组蛋白CSCa溶液；
[0011] (2)将几丁质与重组蛋白CSCa溶液混合均匀，待几丁质与重组蛋白CSCa充分结合 后，向混合溶液中加入NaHC0 3溶液，均匀搅拌后调节pH，再加入CaCl2 · 2H20溶液，搅拌条件 下进行矿化反应，反应结束后，静置取沉淀，沉淀经水洗、冷冻干燥后即为碳酸钙矿化物。
[0012] 上述方案中，所述矿化反应的反应体系中HC(V和Ca2+的摩尔比为1:1;离子浓度为 10mmol/L~20mmol/L 〇
[0013] 上述方案中，所述矿化反应的反应体系中重组蛋白CSCa的质量体积浓度为5mg/L ~30mg/L。
[0014] 上述方案中，所述pH为8~9.5。
[0015] 上述方案中，所述矿化反应的反应时间为30min~60min。
[0016] 上述方案中，所述几丁质与重组蛋白CSCa的质量比为2500:1~5000:1。
[0017] 本发明的有益效果如下：（1)本发明成功构建了一种重组蛋白CSCa，并成功利用该 重组蛋白CSCa实现了对碳酸钙生物矿化过程的调控，为后续研究多蛋白对生物矿化过程的 作用机理提供了支持，更为新型有/无机复合材料的合成开拓了一条新的渠道；（2)本发明 所述方法制备得到的碳酸钙与普通碳酸钙的形貌有较大差别，不仅能生成自然界中处于不 稳定状态的球文石，而且在此重组蛋白的作用下，还能使球文石相稳定保持一段时间，这在 矿化过程中是一个不常见的现象，对于更深层面的理解矿化机制有着很大的促进作用；（3) 本发明制备方法简单易操作，制备成本低，反应条件温和。
【附图说明】
[0018] 图1为实施例1中构建成功的pTWIN ι-CSCa质粒图谱。
[0019] 图2为实施例1中菌株成功表达的重组蛋白CSCa的蛋白质电泳图，其中第1列为 Marker，第2列为未加入IPTG(诱导表达剂)时菌液条带，第3列为加入IPTG后菌液条带。
[0020] 图3为实施例2中重组蛋白CSCa纯化透析操作的蛋白质电泳验证图，其中第1列为 Marker，第2列为高压破碎离心后所得上清条带，第3列为离心后所得沉淀条带，第4列为蛋 白上清与几丁质结合之后条带，第5~10列分别为使用lml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml洗脱液洗 脱之后条带。
[0021] 图4为实施例3中（1)条件下制备的碳酸钙的SEM图。
[0022]图5为实施例3中（1)条件下制备的碳酸钙的XRD图谱。
[0023]图6为实施例3中（3)条件下制备的碳酸钙的XRD图谱。
【具体实施方式】
[0024]为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的 内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0025] 实施例1重组蛋白CSCa的构建和表达
[0026]实验设计重组蛋白CSCa由三个片段组成:几丁质结合区域、蚕丝蛋白重复序列、钙 离子结合区域。几丁质结合序列来源于载体质粒PTWIN1上的CBD序列，碱基序列如SEQ ID NO.4所示;蚕丝蛋白重复序列来源于家蚕的蚕丝蛋白，蚕丝蛋白重复序列的碱基序列如SEQ ID N0.5所示;钙离子结合序列来源于MS17蛋白的钙结合区域，碱基序列如SEQ ID N0.6所 不。
[0027] 首先通过PCR操作将目的基因片段扩增出来，然后对载体质粒进行酶切，然后用 DNA连接酶将载体质粒和PCR产物进行过夜连接，最后将连接产物转化到感受态细胞中，通 过DNA电泳及测序验证，成功构建得到含有几丁质结合区域、蚕丝蛋白重复序列和钙离子结 合区域基因的重组质粒pTWIN Ι-CSCa。所述重组质粒pTWIN Ι-CSCa的质粒图谱见图1。
[0028] 按照配比（NaCl 10g，Tryptone 10g，Yeast Extract 5g)配置液体培养基（1L)并 调节pH(7.0-7.2)后，加入相应量的琼脂粉(2g/100ml)，高压灭菌20min后，不烫手之后加入 相应量的抗生素氨苄（100ul/100ml)，并倒平板。用枪头沾取少量菌种后倾斜划线，倒扣放 置于37°C烘箱中过夜。从已长出菌落的平板上挑菌，接种到6ml已加入6ul氨苄的液体培养 基中，放到37°C摇床过夜，然后转移到300ml液体培养基中扩大培养，待其OD600值约为0.25 时，加入相应量的IPTG(100ul/100ml)，诱导蛋白表达。约3小时后，离心收集菌体，-20°C保 存。通过蛋白质电泳图（见图2)可以知道菌体成功表达。
[0