一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及蛋白和多肤制备领域，更具体地，设及胶原蛋白肤的领域。
【背景技术】
[0002] 癌症是人们死亡的主要原因之一。在身体组织中，细胞分化属于生理过程，在正常 的生理环境下，细胞的增殖和死亡保持一定的平衡。外界环境如射线、空气污染等会导致人 体DNA发生突变，从而打破人体正常的调控过程导致癌症的产生。无论在细胞层面还是基因 层面，癌症产生的过程中细胞承受不可控的分化，形成恶性肿瘤并扩散至身体其他部位。美 国癌症学会预计:2015年，美国将新增21，290例卵巢癌病例，约14，180名妇女死于卵巢癌。 卵巢癌在女性死亡率中位列第五，超过其他的女性生殖系统疾病。女人一生中患卵巢癌的 风险是1/75,死于卵巢癌的概率是1/100(统计数据中不包含低恶性的卵巢肿瘤）。
[0003] 食品来源的生物活性肤代表一类能促进人类健康的资源，由于运些活性肤可W在 胃肠消化过程中被吸收，并产生活性，进而为预防或治疗慢性疾病提供新的应用。近年来， 多肤已经被公认为具有生物活性，比如调节免疫，抗微生物，抗高血压，抗血栓形成，抗癌， 抗氧化和降低胆固醇活性，运些活性多肤来源于牛奶，麦子，大豆，鸡蛋，鱼蛋白等植物和动 物，通过酶水解法或发酵法制备。
[0004] Takashi等研究发现猪皮明胶能够抑制K-562，HCT15和AGS细胞的增殖（Takashi Kojima et al.，2003，CANCER BIOT皿RAPY&RADI0PHARMACEUTICALS，18(2):147-155)。 G.A.化stro等考察了乳清分离蛋白和胶原水解物对黑素瘤癌细胞B16F10的生长抑制作用 和对细胞周期的影响，结果表明乳清分离蛋白和胶原水解物对于B16F10细胞具有明显的生 长抑制作用，半数抑制浓度IC50在0.19~156.9mg/mL之间，牛胶原水解物对于B16F10细胞作 用的半数抑制浓度 1C日日低于lmg/mL(G.A.Castroet al. ,2009 Journal of Dermatological Science，56:51-57)。经过高溫灭菌的黄娜鱼经胃酶水解的产物对人前列腺癌细胞DU145具 有抑制增殖作用，ICso为13.67mg/血，对人肺癌细胞1299的半数抑制浓度ICso为25.17mg/mL (Ru Song et al.，2011，Ma;r.Drugs, 1142-1156)。泥餓经木瓜蛋白酶水解后的产物对肝癌 细胞化pG2,乳腺癌细胞MCF-7和直肠癌细胞化CO-2的增殖具有抑制作用，当蛋白浓度达到 40mg/mL时，胎pG2和MCF7的增殖率仅为对照组（不加多肤组）的7 %和4 %化i jun You et al.,2011,Journal of Agricultural and Food Chemistry，59:7948-7953)。
[0005] 从觸鱼酱分离出的疏水肤对淋己瘤细胞U937增殖具有抑制作用，肤的氨基酸组成 为丙氨酸和苯丙氨酸，分子量为440.9Da(化ung Gon Lee et日1.，2004,8;[0化(31:0'3,21: 63-67)。金枪鱼酱汁水解物对于人乳腺癌细胞MCF-7的增殖具有抑制作用，经超滤膜分离的 分子量大于2500化的组分对MCF-7的增殖具有更高的抑制率，IC50为1.39mg/血，采用多种色 谱手段对产物进行分离纯化，得到两个抗癌活性肤，并对其测序，肤的序列为 KPEGMDP化SEPEDRRDGAAGPK(2449.292Da)和KLPP1XLAKLLMSGKL LAEPCTGR(2562.40加 a) (Chuan-Chuan Hung et al.,2014, Journal of Functional FoodsΠ，http :// dx.doi.o^/10.1016/j.jff.2014.08.015)。
[0006] Kuo-化iang Hsu采用商品化蛋白酶水解金枪鱼黑肌肉副产物，鉴定它们对人乳腺 癌细胞MCF-7的抑制增殖活性，该水解肤用凝胶过滤和高效液相色谱HPLC进行纯化，得到两 个抗癌肤，其氨基酸序列为 Leu-Pro-His-'Va^L-Leu-Thr-Pro-Glu-Ala-Gly-Ala-T 虹（分子量 为 1206Da)和 Pro-Thr-Ala-Glu-Gly-Val-Tyr-Met-化 l-Thr(1124Da)，两者对 MCF-7 细胞的 抗增殖作用有剂量依赖性，IC50分别为8. ΙμΜ和8.祉M，运个结果表明金枪鱼黑肌肉副产品对 于抑制癌细胞增殖方面具有潜在的药用价值（Kuo-Chiang Hsu et al.，2011，Food Chemis化y，44:1044-1051) sAlem自η考察了銳鱼明胶水解物对人乳腺癌细胞MCF-7和脑癌细 胞U87的抗增殖活性，半数抑制浓度1C日日分别为0.13和O.lOmg/mUA.Alem自n，2011，Food Research International，44:1044-1051)。因此蛋白活性肤具有多种活性效果，特别是对 肿瘤细胞的抑制活性对于肿瘤药物的研发具有重要的意义，本发明的目的在于提供一种具 有抑制癌细胞增殖的胶原蛋白活性肤。
【发明内容】
[0007] 本发明第一个要解决的技术问题在于提供一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原 蛋白活性肤。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0009] -种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肤的制备方法，其包括如下步骤：
[0010] 1)将明胶用水配审喊浓度化0-25%的明胶溶液；
[0011] 2)将所述明胶溶液加热至40-75°C，调节抑至5.0-6.5;加入木瓜蛋白酶进行酶解， 获得第一酶解反应液；
[0012] 3)调节所述第一酶解反应液的溫度至40-75°C，调节抑至7.0-8.5,加入膜蛋白酶， 获得第二酶解反应液；
[001引4)调节第二酶解反应液的抑至5.5-6.5;
[0014] 5)灭活第二酶解反应液中的蛋白酶;然后冷却第二酶解反应液至40°CW下，得到 粗产物溶液；
[0015] 6)过滤所述粗产物溶液；
[0016] 7)用截留分子量为1500化的超滤膜过滤所述粗产物溶液，获得第一透过液；
[0017] 8)用截留分子量为300Da的超滤膜浓缩所述第一透过液，获得浓缩液，冷冻干燥；
[0018] 9)采用阳离子交换柱对步骤8)的干燥产物进行纯化；
[0019] 10)对步骤9)得到的纯化产物进行脱盐处理，获得胶原蛋白活性肤溶液。
[0020] 11)对步骤10)得到的胶原蛋白活性肤溶液进行冷冻干燥，得粉末状胶原蛋白活性 肤。
[0021] 优选地，步骤2)中所述木瓜蛋白酶的酶量为干明胶质量的酶解反应时间 总计为30分钟-4小时。
[0022] 优选地，步骤3)中膜蛋白酶加入量为干明胶质量的酶解时间为30分钟-4 小时。优选地，膜蛋白酶酶解溫度为50-55°C。
[0023] 明胶主要来源于胶原，而胶原是细胞外纤维蛋白。通过木瓜蛋白酶和膜蛋白酶的 酶解作用，明胶分子被降解为分子量不同的多肤，即胶原蛋白肤。
[0024] 所述明胶选自牛骨明胶、猪骨明胶和鱼皮明胶中的一种或多种。
[0025] 所述灭活蛋白酶的方法为加热灭活，优选地，加热溫度为95-100°C，更优选地，在 溫度为95-100°C保持15分钟灭活蛋白酶。
[0026] 优选地，采用冷却循环系统冷却第二酶解反应液，更优选地，在30分钟内将第二酶 解反应液降至40°C W下，W避免第二酶解反应液中肤段的进一步降解。优选地，用氨氧化 钢、碳酸氨钢或者巧樣酸钟调节步骤3)中第一酶解液的抑值，更优选地，用食品级氨氧化钢 调节步骤3)中第一酶解液的pH值。
[0027] 优选地，用巧樣酸、醋酸或者憐酸调节步骤4)中第二酶解反应液的pH值，更优选 地，用食品级巧樣酸调节步骤4)中第二酶解反应液的pH值。
[0028] 用碳酸氨钢、憐酸或者巧樣酸调节步骤2)中明胶溶液的pH值。
[0029] 优选地，用棉饼过滤器过滤粗产物溶液，W去除溶液中微量肉眼可见杂质。
[0030] 使用截留分子量为1500Da的超滤膜过滤所述粗产物溶液，W获得能够穿过滤膜 的、分子量小于1500化的胶原蛋白肤，为了提高胶原蛋白肤的获得率，使粗产物溶液中胶原 蛋白肤浓度维持在5 ± 0.5 % (该浓度为质量体积浓度），浓缩后，向粗产物溶液中加入水，优 选加入去离子水，使粗产物溶液的胶原蛋白肤浓度控制在5±0.5%。当透过液中分子量小 于1500化的胶原蛋白肤的浓度为0.1% (该浓度为质量体积浓度）W下时，停止过滤。
[0031] 用截留分子量为300Da的超滤膜浓缩所述第一透过液，获得浓缩液和第二透过液， 通过滤除水分子达到浓缩胶原蛋白肤的目的，同时还可进一步除去低于300Da的胶原蛋白 肤。最终浓缩液中保留的是分子量低于1500化，高于300Da的胶原蛋白肤。优选地，当第二透 过液中低于分子量低于300Da的胶原蛋白肤浓度低于0.1%时停止浓缩，当浓缩液中蛋白肤 浓度大于10%，第二透过液中分子量低于300Da的胶原蛋白肤浓度仍在0.1% W上时，加水 稀释浓缩液，直至透过液中分子量低于300Da的胶原蛋白肤的浓度低于0.1 %，收集浓缩液。 W尽量除去分子量低于300Da的胶原蛋白肤。优选地，采用GE公司的截留分子量为300Da的 纳滤膜浓缩。
[0032] 步骤8)的纯化中收集穿透峰的组分，即收集不与阳离子柱结合的组分。阳离子柱 的纯化用于去除能够结合阳离子柱介质的胶原蛋白肤。
[0033] 通过MTT法测定胶原蛋白活性肤具有抑制抗癌细胞增殖的活性，所述癌细胞包括 卵巢癌细胞和前列腺癌细胞，所述卵巢癌细胞包括SK0V3、0VCAR3、436、SR082，所述前列腺 癌细胞包括 PC3、LnCAPCl、LnCAPC2。
[0034]