一种区分pedv变异株和经典株的套式rt-pcr检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT?PCR检测方法，属于PEDV病毒的快速检测技术领域。本发明为了克服病毒分离鉴定、基因测序繁琐、成本高、耗时长的缺点，也为了解决传统RT?PCR特异性低、灵敏性差的问题；本发明提供了一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT?PCR检测方法，该方法操作简便，使用简单，准确率高，特异性强，灵敏度高，既能检测发病动物机体感染PEDV是否为变异毒株，更能定性检测病料中PEDV的存在与否，极大地方便了生产中对PEDV区分是否为变异毒株的检测技术，更丰富了实验室对PEDV研究的内容。
【专利说明】
一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测方法
技术领域
[0001 ]本发明属于PEDV病毒的快速检测技术领域，特别涉及一种区分PEDV变异株和经典 株的套式RT-PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒引起的猪 的一种高度接触性传染病，它的主要特征是呕吐、水样腹泻和脱水死亡;各种年龄的猪均易 感，尤其对1~2周龄哺乳仔猪的危害最为严重，发病死亡率可高达90%~100%，Sun R Q等 报道2010年10月开始，中国南方有超过十个省爆发了PEDV，导致超过100万头仔猪死亡，给 养猪业带来了很大的经济损失。早发现、早确诊对该病的防治意义重大。要做到早确诊就需 要在临床上运用一种简便、快速、敏感、特异的诊断方法。
[0003] 目前，可鉴定PEDV病毒分型的主要方法主要是:病毒的分离鉴定以及测序;分子诊 断技术;聚合酶链式反应(RT-PCR)技术。作为传统的检测方法，PEDV的病原学检测和分子诊 断技术在着许多问题。
[0004] PEDV的分离只能在实验室进行，需要较高的技术水平和较先进的实验条件，操作 困难，所需周期长，PEDV目前只可在个别种类的细胞上生长繁殖(如vero细胞，ST细胞)又由 于胰酶对PEDV纤突糖蛋白的切割作用增强了该病毒对Vero细胞的感染力，所以传代须加入 一定浓度的胰酶用于增强病毒在细胞上的适应性，病毒分离期间出现CPE比较困难，并且试 验需进行很长时间。病毒分离以后为了最终确认该组织中的病毒是否变异，还需借助基因 测序并通过遗传进化分析判断其是否发生变异。虽然这种方法可以作为确诊PEDV是否为变 异毒株的最终诊断依据，但此方法不仅操作繁琐，而且成本高、过程复杂、操作时间长，在临 床上区分是否为变异毒株感染实用价值不大。
[0005] 分子诊断技术的蓬勃发展给TGEV的检测提供了更多的方法，比如:RT_PCR扩增技 术，可设计经典毒株特异性的引物进行PCR扩增后，利用凝胶电泳试验观察片段长度所对应 的位置，确定是否为经典毒株。但在实际操作过程中特异性不强、准确率较低的情况始终存 在，是由于病毒发生变异一般只插入或确实少量的碱基，利用传统RT-PCR很难鉴别病毒的 经典毒株与变异毒株，之后依然要用到基因测序并进行遗传进化分析得到结果，同样操作 繁琐，而且耗费大、耗时多，在临床上也难以加以应用。
[0006] 所以，一种简便、快速、特异、敏感且对当前流行的经典毒株与变异毒株进行有效 鉴别的检测方法急需出现，而套式RT-PCR具备上述优点，符合使用要求，适合对PEDV的经典 株与变异株在临床上进行快速检测与鉴定。
[0007] 此套式PCR的原理:据统计，目前爆发的仔猪流行性腹泻很多是由PEDV变异毒株引 起的，Kim S J和H M等指出PEDV只有一个血清型，但是对比其部分S基因发现不同国家和地 区存在多样性。田野等利用世界各地不同分支PEDV的55株做参考，对S抗原表位基因序列进 行进化分析，发现了 S基因的抗原位点发生了 16个碱基的变化。王隆柏等对其7株PEDV流行 毒株的S基因序列比对分析发现，与CV777标准毒株相比，7株PEDV毒株存在多个氨基酸突 变、插入和缺失现象。大量文献表明现在流行的PEDV S基因在58aa处有4个氨基酸(QGVN)的 插入，基于这一原理，根据GenBank中PEDV S基因序列设计合成两对特异性扩增引物，在优 化RT-PCR反应条件的基础上，并完成特异性、敏感性实验及对临床送检样品检测实验，建立 PEDV区分变异毒株与经典毒株的套式RT-PCR检测方法。该套式PCR检测方法使用可识别变 异株的内引物，可以分别鉴定PEDV经典毒株和变异毒株，经典PEDV仅在第一次PCR会产生 749bp的条带，第二次无法产生条带;而变异PEDV在第一次PCR产物中产生760条带，第二次 产生510bp的条带。本实验通过S基因遗传变异分析设计出的套式RT-PCR检测方法，可直接 通过扩增后的产物进行琼脂电泳凝胶试验得到对应目的片段，两次RT-PCR就能快速得出病 毒是否为变异毒株的结果，这将节约大量的时间及测序的成本。目前关于区分PEDV流行毒 株和经典毒株的套式RT-PCR检测技术在国内外还未见报道。经SOOPAT检索，现在并没有设 计针对PEDV S基因引物而对PEDV经典毒株与变异毒株鉴别检测技术的申报和授权。
[0008] 综上所述，为了克服病毒分离鉴定、基因测序繁琐、成本高、耗时长的缺点，也为了 解决传统RT-PCR特异性低、灵敏性差的问题，同时也为了创造一种更加通用、在临床上更具 有普适性的快速、准确、特异性强的检测区分经典与变异PEDV的方法，本试验研究发明了区 分PEDV流行毒株和经典毒株的套式RT-PCR检测技术，该方法操作简便，使用简单，准确率 高，特异性强，灵敏度高，既能检测发病动物机体感染PEDV是否为变异毒株，更能定性检测 病料中PEDV的存在与否，极大地方便了生产中对PEDV区分是否为变异毒株的检测技术，更 丰富了实验室对PEDV研究的内容。
【发明内容】
[0009] 鉴于当前鉴定PEDV毒株是否为变异毒株只能依靠病毒分离、RT-PCR扩增后测序等 方法，这些方法耗时长，特异性不强，花费高，不能很好快速通过一次试验直接鉴别变异毒 株从而监测猪群发生疫情时的具体致病毒株，本发明提供一种区分PEDV变异株和经典株的 套式RT-PCR检测方法。本发明的检测方法适用于对PEDV病毒的快速检测，主要应用于鉴别 检测猪流行性腹泻病毒经典毒株与变异毒株、猪场快速诊断PEDV及其流行病学的监测。
[0010] 本发明针对PEDV流行毒株存在多处变异的S基因，利用两对引物进行套式RT-PCR 试验能够快速、准确、高效的对组织病料、细胞培养物等中含有的PEDV进行毒株是否变异的 检测和分析。用此套式PCR既能在PEDV临床检测中快速鉴定是否为变异毒株又能在指导合 理预防治疗等方面的提高参考依据。
[0011] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测方法，包括以下步骤：
[0012] ⑴合成目的片段:根据变异毒株的碱基插入原理，通过GenBank中PEDV的S基因序 列，利用DNA Star软件进行同源性分析后，完全自主设计TGEV荧光定量PCR检测方法的引 物；
[0013] 应用Primer Premier5.0软件设计和筛选出两对引物，
[0014] 外引物上游PEDV/F-1:5 ' -AACACTTAGCCTACCACA-3 ' ；
[0015] 外引物下游PEDV/F-2:5 ' -GTGGAATCATTGGACAA-3 ' ；
[0016] 内引物上游raDV/R-1:5 ' -GAAAACCAGGGTGTCAA-3 ' ；
[0017] 内引物下游Pmv/R-2:5 ' -GAAATACCATCCTCACCAG-3 ' ；
[0018] (2)套式RT-PCR扩增反应:将PEDV毒株用Trizol法提取总RNA后进行反转录反应:2 y L的RNA、1 yL的PEDV/F-2下游引物和3y L的ddH20混匀，7 0 °C反应1 Omi n，然后冰上急冷两分 钟；此反应混合溶液再加入2此 5 XMLV buffer，0.5yL dNTP Mixture，0.25yL RNase Inhibitor，0.25yL M-MLV以及lyL ddH20;经42°C保温lh后，70°C保温 15min，冰上冷却反应 终止得cDNA;
[0019] 取2yL cDNA作为模板进行第一次PCR扩增：反应体系为：10XPCR buffer2.5yL， dNTP Mixture 2yL，外引物上游PEDV/F-1 和外引物下游PEDV/F-2各lyL，r-Taq酶0? 5yL， ddH20 16yL并混合均匀；按照下列条件进行扩增:94°C预变性5min; 95°C变性30s，49°C复性 30s，72 °C延伸30s，30个循环;最后72 °C延伸lOmin终止反应；
[0020] (3)第二次套式RT-PCR扩增反应:取2yL第一次PCR产物作为模板，进行第二次PCR 扩增，配置25yL反应体系：10XPCR buffer 2.5yL，dNTP Mixture 2此，内引物上游PEDV/R-1和内引物下游PEDV/R-2各lyL，r-Taq酶0.5yL，ddH20 16yL混合均匀；按照下列条件进行扩 增:94°C预变性5min;95°C变性30s，51°C复性3〇8,72°(：延伸3〇8,30个循环 ；最后72°(：延伸 lOmin终止反应;实现区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测。
[0021] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0022] 1.本发明设计了这两对引物分别进行两组试验，用以确定两对引物最佳退火温 度，分别设定6个退火温度进行梯度PCR。各个退火温度均能扩增出条带，PEDV/F-1、PEDV/F-2引物在49.1°C时条带最清晰，并且无特异性条带;PEDV/R-1、PEDV/R-2引物在51.2 °C时最 清晰，并且无特异性条带。这两个退火温度确定为最佳退火温度。
[0023] 2.该方法首先利用外引物PEDV/F-1和PEDV/F-2扩增出第一次RT-PCR的外片段产 物，这时五株PEDV的毒株(经典毒株和变异毒株)都在外片段中扩增，经1%的琼脂糖电泳凝 胶显示出结果大小经典毒株为759bp，变异毒株为760(见图1)。再利用内引物TODV/R-1， PEDV/R-2扩增出第二次RT-PCR产物，经典毒株没有显示扩增片段，而变异毒株扩增片段结 果为510bp(图2)。与预期结果相符。
[0024] 3.以已检测确诊的PEDV、TGEV、H)CoV和RV阳性病料提取的总RNA为模版进行扩增， 使用本套式RT-PCR检测方法，1 %的琼脂糖电泳凝胶显示TGEV、PDC〇V和RV的内引物扩增和 外引物扩增均没有目的条带，而PEDV经典毒株结果是外引物扩增有目的条带，而内引物扩 增无目的条带。但PEDV变异毒株则是内引物扩增和外引物扩增均有目的条带。此试验表明 本实验所设计的扩增分析技术特异性较好(图3)。
[0025] 4.将一株经典毒株的PEDV用Trizol法提取的RNA定量，用ddH20进行系列10倍倍比 稀释，取120ng RNA，设7个梯度，1CT1、10_2、10_3、10_4、10_ 5、10_6、10_7，反转录后进行PCR反应， 利用本套式引物检测套式RT-PCR的敏感性。由（图4)可知1(T2至1(T6 (1.2ng至0.12pg)稀释 的PEDV毒株反转录后扩增产物均能检测出510bp的目的片段，l(T7(0.012pg)稀释的PEDV毒 株反转录后扩增产物未检测出510p的目的片段。而外引物RT-PCR仅能扩增到l(T 4(12pg)(图 5)。实验结果显示套式PCR敏感性比常规PCR高出两个数量级。5临床送检的148份病料中有 111份得到"两次都为阳性"的结果，37份病料得到"第一次阳性，第二次阴性"的结果，由试 验可知，111份为变异毒株，37份为经典毒株，变异毒株的比例为75%。对148份病料得到的 产物送往大连宝生物公司进行测序，测序结果表明"两次都为阳性"样本中有碱基插入、变 异；"第一次阳性，第二次阴性"样本为经典毒株的DNA序列。
【附图说明】
[0026]图1为外引物套式PCR扩增产物的电泳检测结果图；其中，M:分子质量标准；1: PEDV 经典毒株外引物扩增产物;2~5: PEDV变异毒株外引物扩增产物；
[0027]图2为套式PCR内引物扩增产物的电泳检测结果图；其中，M:分子质量标准；1 :PEDV 经典毒株内引物扩增产物;2~5:PEDV变异毒株内引物扩增产物。
[0028]图3为套式PCR特异性试验的检测结果图；其中，M:分子质量标准；1 :TGEV外引物扩 增产物；2: TGEV内引物扩增产物;3: PDCoV外引物扩增产物;4: PDCoV内引物扩增产物；5: RV 外引物扩增产物;6: RV内引物扩增产物;7: PEDV经典毒株外引物扩增产物;8: PEDV经典毒株 内引物扩增产物;9: PEDV变异毒株外引物扩增产物;10: PEDV变异毒株内引物扩增产物； [0029]图4为套式PCR敏感性试验的检测结果图；其中，M:分子质量标准；l:12ng;2: 1.2ng ;3:120pg;4:12pg;5 :1.2pg;6:0.12pg;7:0.012pg(10-\10- 2、10-3、10-4、10-5、10-6、10 - 7);
[0030] 图5为常规RT-PCR敏感性试验的结果图；其中，M:分子质量标准；1:12ng;2:1.2ng; 3:120pg;4:12pg; 5:1 ? 2pg( 10-1、10-2、10-3、10-4、10- 5)。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0032] 实施例1样品中RNA的提取
[0033] 1实验材料
[0034]含有PEDV毒株的样品，根据样品采集时间和地点分别命名为MX-2014，MX-2015， HA-2015，NC-2014，NC-2015;含有TGEV毒株的样品命名为QW;含有H)CoV毒株的样品命名为 BC;和含有RV毒株的样品命名为JC。
[0035] 1.1主要试剂
[0036] Trizol总RNA提取试剂；TaqTM酶、反转录酶M-MLV、RNase inhibitor、5XM-MLV bufTer、10XPCR buffer、琼脂糖、DL2000DNA Maker、dNTPs、6XLoading buffer均购自 Takara公司。
[0037] 2试验方法
[0038] 2 ? ITrizol 法提取总 RNA
[0039] 2 ? 1 ? 1 取样品 MX-2014，MX-2015，HA-2015，NC-2014，NC-2015，QW，BC 和 JC 研磨液 2 50 yL到2ml EP管中，加入500yL预冷的Trizol。
[0040] 2.1.2样品剧烈混合，室温放置10min。
[00411 2.1.3加200此氯仿颠倒￡?管两次，剧烈混合至乳白色。室温静置10!^11。之后4°(：， 12000rpm离心 15min
[0042] 2.1.4取上层水相转移至新EP管中，加入等体积异丙醇混匀放置10min。之后4°C， 12000rpm离心15min。离心结束后尽可能除去所有上清液。
[0043] 2.1.5加入lmL 75%DEPC水配置的乙醇溶液洗涤RNA沉淀和管壁，4°C，7500rpm离 心5min〇
[0044] 2.1.6尽可能除去全部乙醇，1?祖沉淀干燥处理后，用25此无1?^86污染的水将1?嫩 溶解。放-20 °C保存备用。
[0045] 实施例2:套式RT-PCR扩增反应
[0046] 1引物的设计
[0047] 应用Primer Premier5.0软件设计和筛选出两对引物，外引物上游PEDV/F-1:5-AACACTTAGCCTACCACA-3 '，外引物下游PEDV/F-2:5 ' 一GTGGAATCATTGGACAA-3 '。
[0048] 2第一次套式RT-PCR扩增反应
[0049] Trizol法提取总RNA后进行反转录反应:2yL的RNA、lyL的PEDV/F-2下游引物和3yL 的ddH20混匀，70°C反应lOmin，然后冰上急冷两分钟。
[0050] 2.1此反应混合溶液再加入2此 5 XMLV buffer，0.5yL dNTP Mixture，0.25此 RNase Inhibitor，0.25yL M-MLV以及lyL ddH20〇
[0051 ] 2.2经42 °C保温lh后，70 °C保温15min，冰上冷却反应终止得cDNA。
[0052] 2.3取2此〇0嫩作为模板进行第一次?0財广增。反应体系为：10\?0?131^€612.511 L，dNTP Mixture 2yL，外引物F1、F2各lyL，r-Taq酶0.5yL，ddH20 16yL并混合均匀。
[0053] 2.4按照下列条件进行扩增:94°C预变性5min; 95 °C变性5min，49°C复性30s，72°C 延伸3〇8,30个循环;最后72°(：延伸1〇111111终止反应。
[0054] 实施例3:第二次套式RT-PCR扩增反应
[0055] 1第二次PCR引物的设计
[0056] 应用Primer Premier5.0软件设计和筛选出两对引物，内引物上游PEDV/R-1:5'一 GAAAACCAGGGTGTCAA-3 '，内引物下游PEDV/R-2:5 ' 一GAAATACCATCCTCACCAG-3 '。
[0057] 2进行第二次套式RT-PCR扩增反应
[0058] 取2yL第一次PCR产物作为模板，进行第二次PCR扩增，配置25yL反应体系：10 XPCR buffer 2.5yL，dNTP Mixture 2yL，外引物R1、R2各lyL，r-Taq酶0.5yL，ddH20 16yL混合均 匀。
[0059] 2.1按照下列条件进行扩增:94°C预变性5min; 95 °C变性5min，51°C复性30s，72°C 延伸30s，30个循环;最后72 °C延伸1 Omin终止反应。获得第二次PCR产物。
[0060] 实施例4:套式RT-PCR退火温度的优化试验
[0061 ] 1利用毒株NA-2015cDNA 2yL作为PCR模版，建立25yL的PCR反应体系（10XPCR buffer 2.5yL，dNTP Mixture 2yL，内引物F1、F2各lyL，r-Taq酶0.5yL，ddH20 16yL混合均 匀）。PEDV/F-1、PEDV/F-2引物在48°C~50 °C之间设定6个退火温度（分别为:48 ? 0 °C，48 ? 4 °C，48.8°C，49.1°C，49.5 °C，50.0°C )进行梯度PCR，经电泳凝胶试验，紫外凝胶成像系统观 察结果到49.1°C时条带最亮，说明内引物FI、F2最佳退火温度应为49.1°C。
[0062] 2利用第一次PCR产物2yL作为PCR模版，建立25yL的PCR反应体系（10 X PCR buffer 2.5yL，dNTP Mixture 2此，外引物R1、R2各lyL，r-Taq酶0.5yL，ddH20 16yL混合均匀）。 PEDV/R-1、PEDV/R-2引物在50 °C~52 °C之间设定6个退火温度（分别为：48.0 °C，48.4 °C， 48.8°C，49.1°C，49.5°C，50.0°C)进行梯度PCR，经电泳凝胶试验，紫外凝胶成像系统观察结 果到51.2°C时条带最亮，说明内引物FI、F2最佳退火温度应为51.2°C。
[0063]实施例5:套式RT-PCR的特异性试验
[0064] 1 利用 Tr i zo 1 法提取毒株 QW，BC 和 JC，MX-2014，MX-2015 (TGEV、PDCoV、RV 和 PEDV)的 总RNA后，反转录得cDNA。建立25yL的PCR反应体系（10XPCR buffer 2.5yL，dNTP Mixture 2yL，内引物FI、F2各lyL，r-Taq酶0 ? 5yL，ddH20 16yL混合均匀)得到第一次PCR产物。
[0065] 2利用第一次PCR产物所得DNA建立25yL的PCR反应体系（10XPCR buffer 2.5yL， dNTP Mixture 2yL，外引物R1、R2各lyL，r-Taq酶0.5yL，ddH20 16yL混合均匀）得到第二次 PCR产物的。取5yL PCR扩增产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果。 结果见图3，了6￡￥、^)(：〇￥、1^的毒株都没有显示目的条带，而]\?-2014，]\?-2015显示出了对应 的目的条带，说明此方法具有特异性。
[0066] 实施例6:套式RT-PCR的敏感性试验
[0067] 将一株PEDV的变异毒株(HA-2015)用Trizol法提取RNA，核酸蛋白检测仪检测总 RNA浓度及质量在检测RNA质量前，将核酸蛋白检测仪预热lOmin.用与溶解RNA相同的RNase free dH20调零，测定RNA样品的0D值，得出0D260/0D280 ? 2,再取120ng RNA，利用ddH20进 行系列1 〇倍倍比稀释，设7个梯度，1 (T1、10_2、10_3、10_4、10_ 5、10_6、10_7，反转录后进行PCR反 应，利用本套式引物检测套式RT-PCR的敏感性。将此7个RNA样本使用引物FI、F2和Rl、R2进 行两次PCR试验，并使用电泳凝胶试验观察结果。由（图4)可知1(T 2至l(T6(1.2ng至0.12pg) 稀释的PEDV毒株反转录后扩增产物均能检测出510bp的目的片段，l(T 7(0.012pg)稀释的 PEDV毒株反转录后扩增产物未检测出510bp的目的片段。而外引物RT-PCR仅能扩增到1(T 4 (12pg)(图5)目的片段为760bp。实验结果显示套式PCR敏感性比常规PCR高出两个数量级。 [0068]实施例7:临床样品的检测
[0069]对广东省内不同五个城市临床送检的已经过常规RT-PCR检测的148份PEDV阳性病 料进行套式RT-PCR，并用琼脂糖凝胶电泳进行第一次RT-PCR产物（引物F1、F2)和第二次RT-PCR产物（引物Rl、R2)试验观察结果。
[0070] 经琼脂糖凝胶电泳检测，临床送检的148份病料中有111份得到"两次都为阳性"的 结果，37份病料得到"第一次阳性，第二次阴性"的结果，由试验可知，111份为变异毒株，37 份为经典毒株，变异毒株的比例为75%。对148份病料得到的产物送往大连宝生物公司进行 测序，测序结果表明"两次都为阳性"样本中有碱基插入、变异；"第一次阳性，第二次阴性" 样本为经典毒株的DNA序列。
[0071] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 合成目的片段:根据变异毒株的碱基插入原理，通过GenBank中PEDV的S基因序列， 利用DNA Star软件进行同源性分析后，完全自主设计TGEV荧光定量PCR检测方法的引物； 应用Primer Premier5.0软件设计和筛选出两对引物， 外引物上游PEDV/F-1的序列如SEQ ID ΝΟ:1所示； 外引物下游PEDV/F-2的序列如SEQIDNO:2所示； 内引物上游PEDV/R-l的序列如SEQIDNO:3所示； 内引物下游PEDV/R-2的序列如SEQ ID N0:4所示； (2) 套式RT-PCR扩增反应:将PEDV毒株用Trizol法提取总RNA后进行反转录反应:2yL的 RNA、lyL的PEDV/F-2下游引物和3yL的ddH20混匀，70°C反应lOmin，然后冰上急冷两分钟；此 反应混合溶液再加入2yL 5 XMLV buffer，0.5yL dNTP Mixture，0.25yL RNase Inhibitor，0.25yL M-MLV以及lyL ddH20;经42°C保温lh后，70°C保温 15min，冰上冷却反应 终止得cDNA; 取2yL cDNA作为模板进行第一次PCR扩增：反应体系为：10XPCR buffer 2.5yL，dNTP Mixture 2yL，外引物上游PEDV/F-1 和外引物下游PEDV/F-2各lyL，r-Taq酶0.5yL，ddH20 16 yL并混合均匀；按照下列条件进行扩增:94°C预变性5min; 95°C变性30s，49°C复性30s，72°C 延伸3〇8,30个循环;最后72°(：延伸1〇1^11终止反应； (3) 第二次套式RT-PCR扩增反应:取2yL第一次PCR产物作为模板，进行第二次PCR扩增， 配置25yL反应体系：10XPCR buffer 2.5yL，dNTP Mixture 2yL，内引物上游PEDV/R-1 和内 引物下游PEDV/R-2各lyL，r-Taq酶0.5yL，ddH2016yL混合均匀；按照下列条件进行扩增:94 °C预变性5min; 95°C变性30s，51°C复性30s，72°C延伸30s，30个循环;最后72°C延伸lOmin终 止反应;实现区分PEDV变异株和经典株的套式RT-PCR检测。
【文档编号】C12N15/11GK105821159SQ201610246485
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月20日
【发明人】贺东生, 焦臣鹏, 王飞, 陈小芬, 苏丹萍, 罗华林
【申请人】华南农业大学