Klotho基因编辑在异种肾脏移植中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种Klotho基因编辑在异种肾脏移植中的应用。通过对klotho基因的编辑来保护异种肾脏免受急性和慢性损伤，维持异种肾脏正常的状态和功能，延长异种肾脏在受体内的存活时间。
【专利说明】
Kl otho基因编辑在异种肾脏移植中的应用
技术领域
[0001] 本申请涉及异种器官移植领域，涉及对异种器官供体进行抗衰老基因编辑。
【背景技术】
[0002] 器官移植是器官衰竭疾病末期最有效的治疗手段，但是供体器官短缺的现状严重 制约了器官移植手术的开展。我国供体器官短缺状况极为严重，每年仅肾脏移植患者就多 达100万，而全国可以开展的肾脏移植手术不超过1万例，因此，同种异体器官已经远远不能 满足器官移植的需要，亟待寻找新的供体器官来源。
[0003] 异种器官移植是指将其它物种的器官、组织和细胞移植到人体。异种器官来源丰 富，有望成为解决人类供体器官不足的根本途径之一。其中，猪器官的构造、大小、血管分布 与人极为相似，因此，猪成为了最为理想的异种器官来源。在过去的十几年间，开展了大量 猪到灵长类动物的异种器官移植研究和实验，也取得了显著的进步。
[0004] 与同种异体器官移植相比，由于不同物种之间的遗传背景差异更大，异种器官移 植后产生的免疫反应也会更加强烈。为此，大量的研究专注于克服异种器官移植所伴随的 强烈免疫排斥反应。按照发生的先后顺序，异种器官移植的免疫排斥反应分为:超急性免疫 排斥反应、急性血管排斥反应、细胞排斥反应以及慢性排斥。超急性排斥反应主要由于在猪 的细胞表面存在α-1，3半乳糖基抗原决定簇，而人体存在相应的天然抗体。当猪的器官植入 人体后，体内存在的天然抗体与α-1，3半乳糖基抗原决定簇结合，并激活补体系统，使得植 入人体的异种器官在数分钟到数小时内，因免疫排斥而坏死。为了克服超急性免疫排斥反 应，在2003年时，Phelps等人获得了敲除了α-l，3半乳糖转移酶基因的克隆猪（GTK0)，在 2005年Kuwaki等人将GTK0修饰的猪心脏成功地移植到狒狒体内，该异种心脏在狒狒体内的 最长存活时间达6个月。该实验结果表明，对异种器官的基因修饰能够有效地抑制异种移植 物在受体内的免疫排斥反应。
[0005] 除了强烈的免疫排斥反应之外，异种器官移植面临的另一个挑战是异种器官在受 体内的凝血功能异常和血栓性微血管病。血管内凝血紊乱主要是由免疫排斥引起血管内皮 损伤和不同物种之间凝血调节相关的信号分子和受体存在一些差异，导致内皮细胞的激 活；内皮细胞的损伤和活化会导致广泛血栓、出血和组织坏死。为此，Mohiuddin等人在 GTKO/h⑶46双基因修饰的基础上，将人的凝血调节蛋白基因转入猪的基因组，该三基因修 饰的GTKO/h⑶46/hTBM猪心脏移植到狒狒体内存活的时间超过了 1年。
[0006] 异种肾脏移植面临的问题更为复杂。将GTK0/hCD46双基因修饰的猪肾脏移植到狒 狒体内后，最长存活时间为83天，远短于相同条件下异种心脏的存活时间（236天）。除了存 活时间短，肾脏移植后容易出现由慢性肾病导致的移植肾慢性失功。慢性肾病的发生是多 因素导致的，包括免疫排斥、免疫抑制剂的肾毒性、微血管病变等。因此，为了延长异种肾脏 在人体存活时间和维持异种肾脏在人体正常功能，需要进行新的基因修饰。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种新的异种肾脏移植方法。
[0008] 本发明提供一种Klotho基因编辑在异种肾脏移植中的应用。
[0009] 可以将人Klotho基因转入猪的基因组，将经过修饰的猪肾脏移植到人体。
[0010] 一种人Klotho基因在制备保护猪血管内皮细胞的试剂中的应用。
[0011] 随着人Klotho浓度增大，对猪血管内皮细胞的保护作用不断增强。随着klotho处 理时间的延长，对猪血管内皮细胞的保护作用逐渐增强。
[0012] 一种人Klotho基因在制备抑制猪血管内皮细胞NF-κΒ信号通路的试剂中的应用。
[0013] 一种Klotho基因在制备保护移植肾脏免受损伤的药物中的应用。
[0014] 一种K1 otho基因在制备提高肾脏抗凋亡能力的药物中的应用。
[0015] 该药物通过提高Klotho基因的浓度或含量，来有效保护肾脏和延长移植肾脏的存 活时间。
[0016] Klotho基因可以是人基因或猪基因。
[0017] 本发明的有益效果是：对klotho基因的编辑来保护异种肾脏免受急性和慢性损 伤，维持异种肾脏正常的状态和功能，延长异种肾脏在受体内的存活时间。
【附图说明】
[0018] 图1是显示不同浓度人血清对猪血管内皮细胞溶解作用的结果图；
[0019] 图2是显示不同浓度klotho对猪血管内皮细胞保护作用的结果图；
[0020]图3是显示不同处理时间klotho对猪血管内皮细胞的保护作用的结果图；
[0021] 图4是显示Western blot检测klotho处理对于猪血管内皮细胞NF-κΒ信号通路的 影响的结果图；
[0022]图5是慢病毒载体pLVX-klotho的结构示意图；
[0023]图6是PCR鉴定稳转细胞株的结果图；
[0024]图7是显示人血清对klotho过表达猪血管内皮细胞的杀伤能力的结果图。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0026] Klotho(Genbank ID:9365(人）和ID: 100519728(猪））基因最初被发现时是一个与 抗衰老相关的基因，klotho基因的表达紊乱会导致寿命缩短、高磷血症、动脉粥样硬化和骨 质疏松等一系列表型，而这些表型与慢性肾脏病(CKD)的临床表现具有高度的相似性。在 CKD早期，患者血清中klotho蛋白质含量呈下降趋势，可作为较早出现的生物学标志物之 一，而且随着CKD的发展klotho蛋白质含量的下降愈发明显。
[0027] Klotho基因主要在肾脏表达，其产物有膜结合型和分泌型两种蛋白，分别作为膜 结合受体和体液调节因子。klotho蛋白能够调节体内的钙磷代谢平衡减轻CKD患者的血管 钙化，抑制氧化应激保护肾脏免受缺血和炎症的损伤，抑制Wnt通路激活导致的肾小管上皮 细胞凋亡。因此，klotho基因可以作为异种肾脏移植的候选基因，能够保护移植肾脏免受急 性和慢性损伤，提高肾脏的抗凋亡能力，维持移植后肾脏正常的状态和功能。
[0028] -、实验方法
[0029] 1.不同浓度人血清对猪的血管内皮细胞溶解试验
[0030] 将猪血管内皮细胞接种于96孔培养板，每孔2000个细胞，培养至第4天细胞基本铺 满培养板底部，加入含正常人AB型血清的培养液，终浓度分别为5%，10%，25%、40%，以相 应浓度胎牛血清为对照，每组各取3孔。放入37 °C孵箱内孵育2小时后，通过CCK-8检测细胞 存活率，实验重复3次。
[0031] 2.不同浓度klotho对猪血管内皮细胞保护作用
[0032]将猪血管内皮细胞接种于96孔培养板，每孔2000个细胞，待细胞贴壁之后，加入含 人klotho的培养液，终浓度分别为0.2nmol，0.4nmol，0.6nmol，1 .Onmol和1.5nmol，每组取3 孔，孵育48h后，加入终浓度为20 %的正常人AB型血清，放入37°C孵箱内孵育2小时后，通过 CCK-8检测细胞存活率，实验重复3次。
[0033] 3.不同处理时间klotho对猪血管内皮细胞的保护作用
[0034]将猪血管内皮细胞接种于96孔培养板，每孔2000个细胞，待细胞贴壁之后，加入含 人1. Onmol klotho的培养液，分别培养4h，8h，24h，48h和72h，每组取3孔。分别加入终浓度 为20 %的正常人AB型血清，放入37 °C孵箱内孵育2小时后，通过CCK-8检测细胞存活率，实验 重复3次。
[0035] 4. Klotho处理猪血管内皮细胞对NF-κΒ信号通路的影响
[0036]将猪血管内皮细胞接种于6孔培养板，每孔10000个细胞，待细胞贴壁之后，加入含 人1.Onmol klotho的培养液，培养48h。分别加入终浓度为20%的正常人AB型血清处理4h， 2h，40min和20min后，裂解细胞，提取蛋白质，采用&111:;[-11013€[、3111:;[165和3111:;[-301:;[11抗体， 进行Western Blot检测。
[0037] 二、实验结果
[0038] 1.不同浓度人血清对猪的血管内皮细胞溶解
[0039] 如图1所示，随着人血清浓度的提高，猪的血管内皮细胞的存活率不断降低。
[0040] 2.不同浓度klotho对猪血管内皮细胞保护作用
[0041]如图2所示，在低浓度条件下，随着klotho浓度增大，对猪血管内皮细胞的保护作 用不断增强;在1.Onmol条件下，猪血管内皮细胞的存活率最高。
[0042] 3.不同处理时间klotho对猪血管内皮细胞的保护作用
[0043]如图3所示，随着klotho处理时间的延长，对猪血管内皮细胞的保护作用逐渐增 强;在48h时候，klotho对猪血管内皮细胞保护作用最为显著。
[0044] 4. Klotho处理猪血管内皮细胞对NF-κΒ信号通路的影响
[0045]实验证明，A20，H0-1和bcl-2等基因的过表达能显著延长异种器官在受体内的存 活时间。进一步研究发现，这些基因保护功能的发挥都是通过抑制NF-κΒ信号通路来实现。 因此，
【申请人】检测klotho处理猪血管内皮细胞后，调控NF-κΒ信号通路的两个关键蛋白p65 和ΙκΒα在细胞内的含量。
[0046] 如图4所示，随着人血清处理时间的延长，NF-κΒ信号通路呈现先激活后减弱的变 化趋势。使用klotho预处理的猪血管内皮细胞，两个关键调控蛋白ρ65和ΙκΒα含量都显著低 于对照组，该结果表明klotho预处理猪血管内皮细胞后，能减弱NF-κΒ信号通路的激活，与 预期一致。
[0047]表达细胞株构建及杀伤实验
[0048] l、Klotho过表达稳转猪血管内皮细胞株构建
[0049] 以人的cDNA文库为模板，设计上下游引物(F: CCCATGGGCTACCACAGGTAAACATT( SEQ ID N0:2)和R:GGAATTCCATGCCCGCCAGCGCCCCG(SEQ ID N0:3)，斜体分别为EcoRI和Notl酶切 位点）扩增klotho基因 （SEQ ID NO: 1)。经酶切后，构建慢病毒载体pLVX-klotho,经酶切、测 序鉴定后，转染到293T细胞包装慢病毒，经纯化后，感染猪血管内皮细胞，通过puromycin筛 选稳转细胞株，并由 PCR(F:CTACCACAGGTAAACATTCAGGT(SEQ ID N0:4)和 R: ATGCCCGCCAGCGCCCCGCCGCGCCG(SEQIDN0:5))鉴定，鉴定结果如图6所示。慢病毒载体 pLVX-klotho的结构如图5所示。
[0050] 2.人血清对klotho过表达猪血管内皮细胞的杀伤
[00511 将klotho过表达稳转细胞株接种于96孔培养板，每孔2000个细胞，培养48h后加入 终浓度为20 %的正常人AB型血清，放入37 °C孵箱内孵育2小时后，通过CCK-8检测细胞存活 率，实验重复3次。
[0052] 3.人血清对klotho过表达猪血管内皮细胞的杀伤能力
[0053]如图7所示，klotho过表达细胞株耐受人血清杀伤的能力有显著的提高。
[0054]以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
【主权项】
1. 一种Klotho基因编辑在异种肾脏移植中的应用。2. -种人Klotho基因在制备保护猪血管内皮细胞的试剂中的应用。3. -种人Klotho基因在制备抑制猪血管内皮细胞NF-κΒ信号通路的试剂中的应用。4. 一种Klotho基因在制备保护移植肾脏免受损伤的药物中的应用。5. -种Klotho基因在制备提高肾脏抗凋亡能力的药物中的应用。
【文档编号】C12N5/071GK105838661SQ201510936666
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年12月15日
【发明人】牟丽莎, 刘璐, 蔡志明
【申请人】深圳市第二人民医院