基于响应面法的秸秆纤维素乙醇生产方法

基于响应面法的秸秆纤维素乙醇生产方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于响应面法的秸秆纤维素乙醇生产方法，在对里氏木霉产纤维素酶的培养条件进行单因素优化的基础上，以滤纸酶活力(FPA)为响应值，采用响应面法优化确定其最佳培养条件为：麦麸6.27g/L，(NH4)2SO41.4g/L，KH2PO44.0g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，CaCl2·2H2O 0.709g/L，FeSO4·7H2O0.005g/L，ZnCl20.0017g/L，CoCl20.002g/L，MnSO4·H2O 0.0016g/L，pH 5.5，31℃，150r/min，通气量4.0L/min，接种量5％，装液量3.5L，5-L发酵罐培养144h。在最佳培养条件下里氏木霉发酵产生的纤维素酶粗酶液的FPA酶活为60126.5±16.0U/mL。将纤维素酶粗酶液以10％添加量加入秸秆一步转化乙醇的5L发酵体系中，经过144h的发酵，乙醇产量达到7.05％(v/v)。通过响应面法提高里氏木霉的纤维素酶产量，提高秸秆纤维素的水解效率，改进秸秆纤维素乙醇生产工艺，降低生产成本，并减少秸秆预处理过程中产生的环境污染。
【专利说明】
基于响应面法的秸秆纤维素乙醇生产方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基于响应面法的秸杆纤维素乙醇生产方法。
【背景技术】
[0002] 纤维素作为一种普遍存在的可再生资源，如果能得到合理的利用，将会为人类带 来巨大的收益。几十年来，人们对于纤维素的预处理及酶水解过程进行了大量研究，纤维素 在纤维素酶的作用下可以水解生成单糖，单糖再经过微生物发酵可以生成燃料乙醇。纤维 素酶在充分利用农作物秸杆等农副产品废弃物，降解秸杆中的纤维素，开发新能源方面具 有巨大的应用潜力。
[0003] 目前木质纤维素主要的预处理方式包括酸水解、酶水解、热降解、机械降解、离子 辐射降解等途径。其中，化学法和物理法都存在能耗高、污染严重的缺点，而酶促水解方法 具有污染少、效率高、利于工业化生产等特点，已逐渐成为纤维素类物质综合利用的主要途 径。但目前木质纤维素的酶促水解研究还处在起步阶段，水解速率慢、效率低都是制约其在 工业上广泛应用的关键因素。现有的纤维素酶的工艺水平，主要是产量和活性都不高，导致 发酵成本上升，制约了规模化生产乙醇的发展。

【发明内容】

[0004] 本发明提出一种基于响应面法的秸杆纤维素乙醇生产方法，通过响应面法提高里 氏木霉的纤维素酶产量，提高秸杆纤维素的水解效率，改进秸杆纤维素乙醇生产工艺，降低 生产成本，并减少秸杆预处理过程中产生的环境污染。
[0005] 响应面优化法，即响应曲面法（Response Surface Methodology, RSM)，包括试验 设计、建立模型、分析模型合理性和寻求最优解等众多试验与统计技术。响应面分析法是降 低开发成本、优化实验条件、提高生产效率、解决生产实际问题的更为有效地方法。该法在 生物发酵方面已有广泛应用。本文采用Design-Expert 8. 06软件中的Plackett-Burman 设计法、最陡爬坡实验和响应面分析法（RSM)相结合的设计对里氏木霉进行发酵培养基的 优化，用于对秸杆纤维素乙醇的一步发酵生产工艺进行改进。
[0006] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0007] 基于响应面法的秸杆纤维素乙醇生产方法，包括以下步骤：
[0008] 1)纤维素酶粗酶液的发酵：
[0009] a.菌种活化：
[0010] 将在-80°C冰箱中冷冻保存的里氏木霉划线接入到PDA斜面培养基上，30°C培养 5d ；
[0011] b.种子液制备：
[0012] 从PDA斜面上挑取生长良好的菌落，接种到装有lOOmLPDA液体培养基的500mL锥 形瓶中，在30°C、150r/min的摇床上培养至对数期中后期；
[0013] c.里氏木霉产纤维素酶发酵：
[0014] 前期通过单因素实验来确定发酵培养基的碳源、氮源、培养时间，以便得到有利于 产酶的培养基成分；
[0015] 后期在初步优化的发酵培养基的基础上，通过design expert8. 06软件来进行设 计，利用Plackett-Burman设计从经初步优化的培养基成分、培养条件中筛选出对酶活具 有显著影响的3个因素为麦麸、温度和氯化钙，之后针对这3个显著影响因素以及它们的正 负效应进行设计，利用最陡爬坡实验逼近响应值，最后用响应面方法中的Box-Benhnken设 计进行试验，通过实验数据拟合响应面模型，最终确定实验条件，并进行验证；
[0016] 通过上述响应面法确定的培养条件为：
[0017] 发酵培养基的组成成分及各成分浓度为：麦麸6. 27g/L，（NH4) 2S041. 4g/L， ΚΗ2Ρ044· Og/L，MgS04 · 7H20 0· 6g/L，CaCl2 · 2H20 0· 709g/L，FeS04 · 7Η200· 005g/L， ZnCl20. 0017g/L，C〇C120. 002g/L，MnS04 · H20 0· 0016g/L，调节 pH 值为 5. 5 ;
[0018] 5-L发酵罐的发酵条件为：装液量3. 5L，转速150r/min，通气量4. OL/min，温度 31°C，pH值=5. 5，接种量5 %，发酵时间144h ;
[0019] d.粗酶液的制备：
[0020] 发酵完成之后，取出发酵液，温度4°C，5000Xg离心10min，将上清液装入无菌容 器中，即为粗酶液；
[0021] e.纤维素酶粗酶液酶活力测定：
[0022] 采用DNS法测定粗酶液的FPA酶活力，以确定纤维素酶活力大小；
[0023] DNS试剂配制：取6. 3g 3, 5-二硝基水杨酸和262mL浓度为2mol/L的NaOH溶液 加到500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷 却后加蒸馈水定容至l〇〇〇mL,C：于棕色瓶中，7~10d后使用；
[0024] 取洗净烘干的15mL具塞试管，每个试管分别做好标记，包括底物空白，每个试管 做3个平行样，以求取平均值；
[0025] 将待测酶液稀释到合适浓度后，除底物空白的试管外，向每只试管中加入0. 5mL 经稀释过的酶液，加入1. 0mL pH4. 8的柠檬酸缓冲溶液，底物空白加入1. 5mL的柠檬酸缓冲 溶液，向每支试管中加入lcmX 6cm的长方形重量约为50mg的滤纸条，底物空白也加入滤纸 条，将每只试管放入50°C的水浴锅中预热2-3min，将滤纸逐一戳入试管底部，充分浸浴在 液体下，同时计时lh，待反应lh后迅速加入3. OmL的DNS以终止上述酶反应，充分摇匀后沸 水浴5min，快速冷却，取lmL的反应液加水适当稀释后，以底物空白为空白在540nm的波长 下测定吸光值，根据测定的吸光值对照葡萄糖标准曲线计算出FPA酶活力；
[0026] 酶活力单位定义：在一定条件下，由lmL酶液催化反应lh所生成的葡萄糖的μ g 数定义为一个酶活力单位，用U/mL表示；
[0027] 在最优培养条件下，纤维素酶粗酶液的FPA酶活为60126. 5± 16. 0U/mL ;
[0028] 2)小麦秸杆的预处理：
[0029] a.粉碎：将小麦秸杆用粉碎机打成120目至150目的小麦秸杆粉，用于下一步的 生产；
[0030] b.浸泡：使用浓度为1%的NaOH溶液对小麦結杆粉浸泡12小时；
[0031] c.清洗：用清水清洗两遍，洗去小麦秸杆粉中残留的NaOH溶液；
[0032] 3) -步发酵秸杆产乙醇
[0033] a.酿酒酵母的活化：
[0034] 将在-80°c冰箱中冷冻保存的酿酒酵母划线接入到Yro斜面培养基上，30°C培养 2d。
[0035] b.种子液制备：
[0036] 从YH)斜面上挑取生长良好的菌落，接种到装有lOOmLYH)液体培养基的500mL锥 形瓶中，在30°C、150r/min的条件下振荡培养至对数期中后期；
[0037] c. 5-L发酵罐发酵秸杆产乙醇
[0038] 发酵培养基配方：
[0039] 取以下重量百分比的原料：小麦秸杆粉36. 0%、豆饼粉水解液2. 0%、纤维素酶粗 酶液10. 0%以及余量水，按上述配比制成总体积3. 6L的液量，调节pH值为6. 0 ;
[0040] 发酵条件：装液量3.6L，接种量为400.0mL，种子液细胞密度为2.0X10scells/ mL，温度30°C，通气量为0,转速为0, pH值=6.0,发酵时间168h，在发酵过程中，每隔24h 取样一次，测定发酵液中的乙醇含量、残留总糖和还原糖的浓度；
[0041] 发酵144小时乙醇产量达到最高，体积百分比为7. 05%，而此时残余总糖的质量 体积比含量已经降至5. 56 %，秸杆中可利用的成分基本上都转化为了乙醇。
[0042] 本发明的有益效果为：
[0043] 1)采用响应面法优化里氏木霉产纤维素酶的发酵条件，在最佳培养条件下里氏木 霉发酵产生的纤维素酶粗酶液的FPA酶活为60126. 5± 16. OU/mL，大大提高了纤维素酶的 活力和产量；
[0044] 2)采用廉价的农业废弃物麦麸作为纤维素酶发酵生产的主要原料，大大降低了预 处理过程中酶制剂生产的成本；
[0045] 3)采用一步法发酵生产乙醇，将纤维素酶分解纤维素的过程和乙醇的发酵生产过 程结合起来，大大缩短了生产周期，对于乙醇产量的提高和生产成本降低具有重要意义。
【附图说明】
[0046] 图1为葡萄糖标准曲线；
[0047] 图2为不同碳源对CMC酶活（▲)和FPA酶活（?)的影响；
[0048] 图3为不同氮源对CMC酶活（▲)和FPA酶活（?)的影响；
[0049] 图4为培养时间对CMC酶活（▲)和FPA酶活（?)的影响；
[0050] 图5为响应面分析图一（CaCl2与麦麸的相互作用）；
[0051] 图6为响应面分析图二（CaCl2与温度的相互作用）；
[0052] 图7为响应面分析图三（温度与麦麸的相互作用）；
[0053] 图8为5L发酵过程中的乙醇浓度（)和细胞干重（▲)变化；
[0054] 图9为5L发酵过程中的总糖（)和还原糖浓度（▲)的变化。
【具体实施方式】
[0055] 下面通过实施例中的技术方案对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实 施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普 通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的 范围。
[0056] 所用材料：
[0057] 菌种：
[0058] 里氏木霉（Trichoderma reesei)，购自上海艾研生物科技有限公司，编号ATCC 13631 ;酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)，购自上海复祥生物科技有限公司，编号 ATCC 26603。
[0059] 培养基：
[0060] PDA斜面培养基：马玲薯琼脂（PDA)培养基：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水 1000mL煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000mL，加葡萄糖20g，琼脂15~20g，溶 化后分装，121°C灭菌30min，25°C培养6d后使用。
[0061] 种子培养基（g/L) :PDA液体培养基
[0062] 发酵产酶培养基：麦麸 2g，KH2P042g，（NH4)2S041. 4g，MgS040 . 3g，CaCl20. 3g， FeS04 · 7H20 5mg，MnS04l. 6mg，ZnCl2l. 7mg，CoC122. Omg，溶于 lOOOmL 蒸馈水中，自然 pH。
[0063] 仪器：
[0064] 苏州净化SW-CJ-2D型双人单面净化工作台、EPED实验室级超纯水器、HYG-C型多 功能摇床、恒温培养箱、立式压力蒸汽灭菌锅、低温冰箱、PH计、UV759紫外-可见分光光度 计、250mL锥形瓶、培养皿、接种环、BI0STAT 5L发酵罐系统。
[0065] 试剂：
[0066] 滤纸、3, 5-二硝基水杨酸（DNS)、柠檬酸缓冲溶液（PH 4. 0)、柠檬酸缓冲液（PH 4. 8)、羧甲基纤维素钠。
[0067] 基于响应面法的秸杆纤维素乙醇生产方法，包括以下步骤：
[0068] 1)纤维素酶粗酶液的发酵：
[0069] a.菌种活化：
[0070] 将在-80°C冰箱中冷冻保存的里氏木霉划线接入到PDA斜面培养基上，30°C培养 5d ；
[0071] b.种子液制备：
[0072] 从PDA斜面上挑取生长良好的菌落，接种到装有lOOmLPDA液体培养基的500mL锥 形瓶中，在30°C、150r/min的摇床上培养至对数期中后期；
[0073] c.里氏木霉产纤维素酶发酵：
[0074] 前期通过单因素实验来确定发酵培养基的碳源、氮源、培养时间，以便得到有利于 产酶的培养基成分；
[0075] 后期在初步优化的发酵培养基的基础上，通过design expert8. 06软件来进行设 计，利用Plackett-Burman设计从经初步优化的培养基成分、培养条件中筛选出对酶活具 有显著影响的3个因素，之后针对这3个显著影响因素以及它们的正负效应进行设计，利用 最陡爬坡实验逼近响应值，最后用响应面方法中的Box-Benhnken设计进行试验，通过实验 数据拟合响应面模型，最终确定实验条件，并进行验证；
[0076] d.粗酶液的制备：
[0077] 发酵完成之后，取出发酵液，温度4°C，5000Xg离心10min，将上清液装入无菌容 器中，即为粗酶液；
[0078] e.纤维素酶粗酶液酶活力测定：
[0079] 采用DNS法测定粗酶液的FPA酶活力，以确定纤维素酶活力大小；
[0080] DNS试剂配制：取6. 3g 3, 5-二硝基水杨酸和262mL浓度为2mol/L的NaOH溶液 加到500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷 却后加蒸馈水定容至l〇〇〇mL,C：于棕色瓶中，7~10d后使用；
[0081] 取洗净烘干的15mL具塞试管，每个试管分别做好标记，包括底物空白，每个试管 做3个平行样，以求取平均值；
[0082] 将待测酶液稀释到合适浓度后，除底物空白的试管外，向每只试管中加入0. 5mL 经稀释过的酶液，加入1. OmL pH4. 8的柠檬酸缓冲溶液，底物空白加入1. 5mL的柠檬酸缓冲 溶液，向每支试管中加入lcmX 6cm的长方形重量约为50mg的滤纸条，底物空白也加入滤纸 条，将每只试管放入50°C的水浴锅中预热2-3min，将滤纸逐一戳入试管底部，充分浸浴在 液体下，同时计时lh，待反应lh后迅速加入3. OmL的DNS以终止上述酶反应，充分摇匀后沸 水浴5min，快速冷却，取lmL的反应液加水适当稀释后，以底物空白为空白在540nm的波长 下测定吸光值，根据测定的吸光值对照葡萄糖标准曲线计算出FPA酶活力；
[0083] 酶活力单位定义：在一定条件下，由lmL酶液催化反应lh所生成的葡萄糖的μ g 数定义为一个酶活力单位，用U/mL表示；
[0084] 在最优培养条件下，纤维素酶粗酶液的FPA酶活为60126. 5± 16. OU/mL ;
[0085] 2)小麦秸杆的预处理：
[0086] a.粉碎：将小麦秸杆用粉碎机打成120目至150目的小麦秸杆粉，用于下一步的 生产；
[0087] b.浸泡：使用浓度为1%的NaOH溶液对小麦結杆粉浸泡12小时；
[0088] c.清洗：用清水清洗两遍，洗去小麦秸杆粉中残留的NaOH溶液；
[0089] 3) -步发酵秸杆产乙醇 [0090] a.酿酒酵母的活化：
[0091] 将在-80°C冰箱中冷冻保存的酿酒酵母划线接入到YH)斜面培养基上，30°C培养 2d。
[0092] b.种子液制备：
[0093] 从YH)斜面上挑取生长良好的菌落，接种到装有lOOmLYH)液体培养基的500mL锥 形瓶中，在30°C、150r/min的条件下振荡培养至对数期中后期；
[0094] c. 5-L发酵罐发酵秸杆产乙醇 [0095] 发酵培养基配方：
[0096] 取以下重量百分比的原料：小麦秸杆粉36. 0%、豆饼粉水解液2. 0%、纤维素酶粗 酶液10. 0%以及余量水，按上述配比制成总体积3. 6L的液量，调节pH值为6. 0 ;
[0097] 发酵条件：装液量3.61^，接种量为400.01^，种子液细胞密度为2.0\10 8(^118/ mL，温度30°C，通气量为0,转速为0, pH值=6.0,发酵时间168h，在发酵过程中，每隔24h 取样一次，测定发酵液中的乙醇含量、残留总糖和还原糖的浓度；
[0098] 发酵144小时乙醇产量达到最高，体积百分比为7. 05%，而此时残余总糖的质量 体积比含量已经降至5. 56 %，秸杆中可利用的成分基本上都转化为了乙醇。
[0099] 结果与分析：
[0100] 1. 1葡萄糖标准曲线的绘制
[0101] 准确称取100mg葡萄糖，用少量蒸馏水溶剂后定容至100mL，保存于冰箱中备用。
[0102] 取9支具塞刻度试管，分别按表1加入各种试剂。
[0103] 表1葡萄糖标准曲线的配制
[0104]
[0105] 将上述试剂混匀后，在沸水浴条件下反应5min，然后立即冷却，每个试管加蒸馏水 至25mL刻度线，充分混匀后，以空白管溶液作为空白对照，在540nm处测得吸光度。以葡萄 糖含量（mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。结果如图1所示，经统计分 析，得到线性回归曲线为：y = 0. 2755x-0. 0015, R2= 0. 9976,说明标准曲线可信度较高。
[0106] 1. 2单因素实验优化里氏木霉的产酶条件
[0107] 1. 2· 1不同碳源对酶活力的影响
[0108] 实验分别选取了稻草粉、麦麸、乳糖、玉米秸杆、蔗糖5种碳源来对基础发酵产酶 培养基进行优化，通过测定滤纸酶活力（FPA)和羧甲基纤维素钠酶活力（CMC)来表征纤维 素酶活力的大小。酶活力大小如图2所示。
[0109] 由图2可知，麦麸为最佳碳源，玉米秸杆次之，之后为乳糖、蔗糖、稻草粉，麦麸为 最佳碳源，由于纤维素酶是一种诱导酶，而麦麸、玉米秸杆中含有较为丰富的纤维素，纤维 素作为诱导剂，对纤维素酶的合成具有诱导作用。同时，麦麸中含有的丰富的生长因子也是 促进产酶的重要因素。因此，我们选取麦麸作为下一步优化的最佳碳源。
[0110] 1. 2. 2不同氮源对酶活力的影响
[0111] 在以麦麸作为最佳碳源的基础上，实验分别选取了蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸钾、 酵母膏5种氮源来对基础发酵产酶培养基进行优化，通过测定滤纸酶活力（FPA)和羧甲基 纤维素钠酶活力（CMC)来表征纤维素酶活力的大小。酶活力大小如图3所示。
[0112] 由图3可知，该实验中最佳氮源为硫酸铵，酵母膏次之，之后为蛋白胨、硝酸钾、尿 素。硫酸铵为最佳氮源，可能是因为硫酸铵作为氮源，在补充氮元素的同时也能补充硫元 素，对纤维素酶的合成有促进作用。因此我们选取硫酸铵作为下一步优化的最佳氮源。
[0113] 1. 2. 3培养时间对产酶的影响
[0114] 培养时间对产酶的影响如图4所示：
[0115] 由图4可知，培养至72h后才开始显示比较明显的酶活力，到第120h时FPA酶活 力达到最大值，而CMC酶活力在144h时达到最大。
[0116] 1. 3响应面法优化里氏木霉的产酶条件
[0117] 1. 3. lPlackett-Burman设计法筛选重要因素
[0118] 分别选取麦麸、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、PH、温度、接种量8个因素的 高低2个水平，通过Minitabl6软件选用Factors = 8，Runs = 12的PB设计，以FPA酶活 力作为响应值。通过比较各因素的显著性水平，筛选出对FPA酶活力影响较为显著的因素。 实验设计如表2所示：

[0126] 该模型的R2= 0. 9253,说明92. 53%的数据可用此模型解释。模型p值（prob > F) =0.0017 <0.05,表明此模型显著，可在0.05水平上拟合数据。由各因素的p值可看 出，对产酶影响最显著的3个因素依次为：A > G > E，即麦麸>温度>氯化钙，后续实验将 对这3个因素作进一步研究。
[0127] 1.3. 2最陡爬坡实验
[0128] 响应面拟合出方程只在最佳值临近域里才能充分接近真实情形，要先逼近最佳值 区域后才能建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向作为爬坡方 向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳值区域。
[0129] 根据表4中A、E、G 3个因素估计系数的正负效应，依次增大或减小，麦麸、温度和 氯化钙是正效应，应依次增大，其他非显著性因素根据表4中的估计系数的正负取PB设计 中的最大值或最小值，分别为硫酸铵1. 4g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸镁0. 6g/L，PH 5. 5,接 种量5%。
[0130] 表5爬坡实验设计及结果
[0131]
[0132] 由表5可知，随着麦麸、氯化钙以及温度的增加，滤纸酶活力呈现先增大后减小的 趋势，当麦麸为〇. 35g/L、氯化钙为0. 040g/L、温度为31°C时酶活力最大，可知最佳产酶发 酵条件在实验3与实验5之间，故选取实验4作为中心点进行响应面分析。
[0133] 1. 3. 3Box_Benhnken 设计
[0134] 依据P-B实验和最陡爬坡实验确定的主要因素和水平，采用B-B实验进行3因素 3水平的响应面分析实验，实验包括12个析因实验和3个中心实验，其编码水平见表6,实 验设计和结果见表7。借助实验设计软件Design Expert进行数据分析，结果见表8。
[0135] 表 6 Box-Benhnkenn 实验设计
[0136]
[0137] 表 7 Box-Benhnkenn 实验结果
[0138]
[0140] 1.3. 4二次回归拟合及响应面分析
[0141] 通过Design Expert 8. 06软件对实验数据进行二次多项式回归拟合，其统计学上 的显著性由F检验确定，用微分方程计算预测最佳点。通过RSREG(响应面回归）过程进行 数据分析，建立二次响应面回归模型，并进而寻找最优因素水平。通过计算，获得纤维素滤 纸酶活对麦麸、温度、氯化钙的二次多项式回归方程为：
[0142] R2= 39. 16067+1. 90375X ^8. 69500Χ2+2· 35125Χ3-9· 06250XA+1. 198500XA+7· 78 250Χ2Χ3+2. 67833Χ/-3. 39417Χ/+0. 74833Χ/
[0143] 式中，Χρ Χ2、Χ3分别为麦麸、温度、氯化钙的编码水平，1?2为纤维素滤纸酶活的预 测值。该回归方程的方差分析如表8所示，其中模型Ρ = 0. 0283 < 0. 05,失拟项（Lack of Fit)P = 0. 1830 > 0. 05,说明该模型回归显著，而失拟不显著。另外该方程回归系数R2 = 0. 9694,说明回归方程的拟合程度较好，预测值和实测值之间具有高度的相关性，可以应用 于该菌株产纤维素酶的理论预测。
[0144] 表8二次多项模型方差分析
[0145]
[0147] 在获得回归非线性模型之后，为求得培养基各组分最佳值，根据所得到的回归模 拟方程分别对各变量求一阶偏导数，并令其为0,得到一个三元一次方程组，求解此方程 组可得到模型的极值：Χ1 = -0. 73, X2 = -0. 21，X3 = 0. 09,即当麦麸、温度、氯化钙分别 为 0. 3135g/250mL、31°C、0. 0355g/250mL 时，理论最大纤维素酶活为 62281. 3U/mL。根据 二次多项模型利用Design Expert软件绘出响应面分析图，见图5。每个响应面分别代表 着两个独立变量之间的相互作用，此时第3个变量的编码值为0。由响应面图可以看出， 麦麸、温度、氯化钙3个因素之间存在着明显的交互作用，在实验水平范围内，随着麦麸、 温度、氯化钙的量增加，纤维素酶活呈先增加后降低的趋势。当麦麸、温度、氯化钙分别为 0. 3135g/250mL、3rC、0. 0355g/250mL 时达到最佳，纤维素酶活理论值为 62281. 3U/mL。
[0148] 1. 3. 5里氏木霉最佳培养条件的确定及其验证实验
[0149] 通过响应面试验分析结果表明，优化后的产纤维素酶液体发酵培养基为：麦麸 6. 27g/L, (NH4)2S041. 4g/L, KH2P044. Og/L, MgS04 · 7H20 0. 6g/L, CaCl2 · 2H200. 709g/L, FeS04 · 7H20 0. 005g/L, ZnCl20. 0017g/L, C〇C120. 002g/L, MnS04 · H200. 0016g/L, pH 5. 5, 31°C，150r/min，通气量4. OL/min，接种量5%，装液量3. 5L，5-L发酵罐培养144h。在此条 件下，做3组验证实验，得到滤纸酶活力的平均值为60126. 5 ± 16. OU/mL，预测值与实验值 之间具有良好的拟合性，表明模型有效。
[0150] 1. 4 5L发酵罐发酵秸杆产乙醇
[0151] 为了将里氏木霉发酵生产的纤维素酶应用于秸杆纤维素乙醇的生产，以10%的添 加量加入秸杆纤维素原料中进行预处理，使用酿酒酵母进行乙醇发酵。在发酵过程中，每隔 24h取样一次，测定发酵液中的乙醇含量、细胞干重、残留总糖和还原糖的浓度。
[0152] 如图6、图7所示，经过实验室5L发酵罐体系实验，加入了 10%纤维素酶粗酶液的 发酵体系在144小时乙醇产量达到最高，为7.05% (v/v)，而此时残余总糖含量已经降至 5. 56%，秸杆中可利用的成分基本上都转化为了乙醇。还原糖的变化则呈现了先升后降的 趋势，这表明发酵初始时，在纤维素酶的作用下，秸杆中的纤维素大量水解为单糖，而酿酒 酵母刚刚开始生长，此时单糖浓度呈上升趋势；在24h后，由于单糖大量的被酵母转化为乙 醇，因此还原糖浓度大幅度下降，乙醇的产量开始上升。
[0153] 通过单因素实验确定了里氏木霉的产酶培养基的最佳碳源为麦麸、最佳氮源为硫 酸铵、最佳培养（产酶）时间为144h，通过Plackett-Burman设计找出了影响发酵产酶的 3个主要因素：麦麸，温度和氯化钙，然后利用最陡爬坡实验和Box-Benhnken实验设计得出 了最佳培养条件为：麦麸 6. 27g/L，（NH4)2S041. 4g/L，ΚΗ2Ρ044· Og/L，MgS04 · 7H20 0· 6g/L， CaCl2 · 2H20 0· 709g/L，FeS04 · 7H200. 005g/L，ZnCl20. 0017g/L，C〇C120. 002g/L，MnS04 · H20 0· 0016g/L，pH 5. 5, 31°C，150r/min，通气量 4. 0L/min，接种量 5%，装液量 3. 5L，5-L 发酵罐 培养144h。在最佳培养条件下，FPA酶活达到60126. 5± 16. 0U/mL，而优化前FPA酶活力为 27923. 6±22. 5U/mL，提高了 115%，和理论酶活力基本吻合。
[0154] 为了对秸杆纤维素乙醇的生产工艺进行改进，我们使用经最优条件下发酵得到的 纤维素酶粗酶液以10%添加量加入秸杆纤维素乙醇的5L发酵体系中，通过纤维素酶将秸 杆中的纤维素水解为单糖，与此同时酿酒酵母将单糖转化为乙醇。实验结果表明，经过144h 的发酵，乙醇产量达到7. 05%，而此时残余总糖含量已经降至5. 56%，秸杆中可利用的成 分基本上都转化为了乙醇。
[0155] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.基于响应面法的秸杆纤维素乙醇生产方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)纤维素酶粗酶液的发酵： a. 菌种活化： 将在-80°C冰箱中冷冻保存的里氏木霉划线接入到PDA斜面培养基上，30°C培养5d ; b. 种子液制备： 从PDA斜面上挑取生长良好的菌落，接种到装有IOOmLPDA液体培养基的500mL锥形瓶 中，在30°C、150r/min的摇床上培养至对数期中后期； c. 里氏木霉产纤维素酶发酵： 前期通过单因素实验来确定发酵培养基的碳源、氮源、培养时间，以便得到有利于产酶 的培养基成分； 后期在初步优化的发酵培养基的基础上，通过design expert8. 06软件来进行设计,利 用Plackett-Burman设计从经初步优化的培养基成分、培养条件中筛选出对酶活具有显著 影响的3个因素为麦麸、温度和氯化钙，之后针对这3个显著影响因素以及它们的正负效应 进行设计，利用最陡爬坡实验逼近响应值，最后用响应面方法中的Box-Benhnken设计进行 试验，通过实验数据拟合响应面模型，最终确定实验条件，并进行验证； 通过上述响应面法确定的培养条件为： 发酵培养基的组成成分及各成分浓度为：麦麸6. 27g/L，（MM)2SO4L 4g/L，KH2P044. Og/ L，MgSO4 · 7H20 0· 6g/L，CaCl2 · 2H20 0· 709g/L，FeSO4 · 7Η200· 005g/L，ZnCl20.00 17g/L， CoCl20.00 2g/L，MnSO4 · H2O 0· 0016g/L，调节 pH 值为 5. 5 ; 5-L发酵罐的发酵条件为：装液量3. 5L，转速150r/min，通气量4. OL/min，温度31°C， pH值=5· 5,接种量5%，发酵时间144h ; d. 粗酶液的制备： 发酵完成之后，取出发酵液，温度4°C，5000 X g离心10min，将上清液装入无菌容器中， 即为粗酶液； e. 纤维素酶粗酶液酶活力测定： 采用DNS法测定粗酶液的FPA酶活力，以确定纤维素酶活力大小； DNS试剂配制：取6. 3g 3, 5-二硝基水杨酸和262mL浓度为2mol/L的NaOH溶液加到 500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后 加蒸馏水定容至1000 mL,贮于棕色瓶中，7~IOd后使用； 取洗净烘干的15mL具塞试管，每个试管分别做好标记，包括底物空白，每个试管做3个 平行样，以求取平均值； 将待测酶液稀释到合适浓度后，除底物空白的试管外，向每只试管中加入〇. 5mL经稀 释过的酶液，加入1.0 mL pH4. 8的柠檬酸缓冲溶液，底物空白加入I. 5mL的柠檬酸缓冲溶 液，向每支试管中加入IcmX6cm的长方形重量约为50mg的滤纸条，底物空白也加入滤纸 条，将每只试管放入50°C的水浴锅中预热2-3min，将滤纸逐一戳入试管底部，充分浸浴在 液体下，同时计时lh，待反应Ih后迅速加入3. OmL的DNS以终止上述酶反应，充分摇匀后沸 水浴5min，快速冷却，取ImL的反应液加水适当稀释后，以底物空白为空白在540nm的波长 下测定吸光值，根据测定的吸光值对照葡萄糖标准曲线计算出FPA酶活力； 酶活力单位定义：在一定条件下，由ImL酶液催化反应Ih所生成的葡萄糖的μ g数定 义为一个酶活力单位，用U/mL表示； 在最优培养条件下，纤维素酶粗酶液的FPA酶活为60126. 5 土 16. OU/mL ; 2) 小麦結杆的预处理： a. 粉碎：将小麦秸杆用粉碎机打成120目至150目的小麦秸杆粉，用于下一步的生产； b. 浸泡：使用浓度为1 %的NaOH溶液对小麦秸杆粉浸泡12小时； c. 清洗：用清水清洗两遍,洗去小麦秸杆粉中残留的NaOH溶液； 3) -步发酵秸杆产乙醇 a. 酿酒酵母的活化： 将在-80°C冰箱中冷冻保存的酿酒酵母划线接入到YH)斜面培养基上，30°C培养2d。 b. 种子液制备： 从YH)斜面上挑取生长良好的菌落，接种到装有IOOmLYro液体培养基的500mL锥形瓶 中，在30°C、150r/min的条件下振荡培养至对数期中后期； c. 5-L发酵罐发酵秸杆产乙醇 发酵培养基配方： 取以下重量百分比的原料：小麦秸杆粉36. 0%、豆饼粉水解液2. 0%、纤维素酶粗酶液 10. 0%以及余量水，按上述配比制成总体积3. 6L的液量，调节pH值为6. 0 ; 发酵条件：装液量3. 6L，接种量为400.0 mL，种子液细胞密度为2. OX IOsceIlsAiLd^ 度30°C，通气量为0,转速为0, pH值=6. 0,发酵时间168h，在发酵过程中，每隔24h取样一 次，测定发酵液中的乙醇含量、残留总糖和还原糖的浓度； 发酵144小时乙醇产量达到最高，体积百分比为7. 05%，而此时残余总糖的质量体积 比含量已经降至5. 56 %，秸杆中可利用的成分基本上都转化为了乙醇。
【文档编号】C12P19/14GK105886551SQ201410821271
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月26日
【发明人】张曈, 杨文杰, 刘晓燕, 许家兴, 李登超
【申请人】淮阴师范学院