一种从西兰花中提取萝卜硫素的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种从西兰花中提取萝卜硫素的制备方法，属于萝卜硫素领域。本发明首先通过对大肠杆菌进行变异处理，得到产硫代葡萄糖苷酶的大肠杆菌，再将变异大肠杆菌进行培养，然后对西兰花进行处理、超声提取，得到提取液，然后再通过酶解、加入氢氧化钠、正己烷等除去油脂、金属离子、蛋白质等杂质，得到葡萄糖萝卜硫素苷溶液，再将大肠杆菌进行发酵，向发酵液中加入葡萄糖萝卜硫素苷反应，再分别经过离心分离、CO2超临界萃取、常压蒸馏、低温真空冻干，得到萝卜硫素。本发明制备的萝卜硫素产率高，纯度高，可应用于大规模生产中，并且生产时间较常规方法减少了6～8h，纯度达到了95%以上。
【专利说明】
一种从西兰花中提取萝素的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种从西兰花中提取萝卜硫素的制备方法，属于萝卜硫素领域。
【背景技术】
[0002] 萝卜硫素(Sulforaphane)又称"莱菔硫烧"，是葡萄糖萝卜硫苷经黑芥子酶酶解或酸 水解后产生的。它是迄今为止蔬菜中发现的最强的抗癌活性物。萝卜硫素就其化学成分而 言，为异硫氰酸酯类化合物，易溶于水，相对分子质量177.3，分子式C6H11S2NO，它是一种多 功能诱导物，可诱导机体产生Π 型解毒酶一谷胱甘肽转移酶和醌还原酶，此酶可对许多致 癌物产生抗体，从而起到抗癌作用。另外，萝卜硫素还具有抑制DNA去酰化酶的能力。近年来， 随着癌症的发病率的逐渐上升，萝卜硫素作为一种具有较强的抗癌作用的植物活性物质，有 着广阔的研究价值及市场前景。
[0003] 目前制备萝卜硫素的方法有：1.以干燥西兰花种子粉加水水解，获得固液混合物； 再向该混合物中加入无水乙醇，进行超声浸提、抽滤或双层纱布过滤，获得滤液;接着对滤 液进行真空浓缩，蒸发乙醇并获得浓缩液;浓缩液进行大孔树脂层析及用乙醇水溶液进行 梯度洗脱，获得含萝卜硫素洗脱液并继续进行氧化铝柱层析、浓缩，获得萝卜硫素浸膏粗品； 最后将获得的粗品加水溶解后用极性溶剂萃取，收集有机层并真空浓缩获得油状浸膏，即 高纯萝卜硫素。该方法存在的主要问题是未对种子进行洗脱，由于油脂的阻挡，西兰花种 子中的硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶难以有效接触，导致萝卜硫代的生成率低；_未对 水解液进行pH、温度条件的控制，硫代葡萄糖苷酶对硫代葡萄糖苷的水解处于非优化环境， 致使大量杂质生成，分离纯化困难且成本高;：!:用乙酸乙酯萃取的选择度低，不仅可萃取萝 卜硫素，还可萃取其他类似物，且在较高温度下真空浓缩，萝卜硫素不稳定，易重排生成多种 异构体，产品纯度低；i无水乙醇回收率低，生产成本高，缺乏竞争力。2.将新鲜西兰花的食 用部分花枝脱水后烘至恒重并粉碎，获得西兰花干粉;将新获得的介子粉碎提取，再真空抽 滤除杂，得到粗酶液；向所述西兰花干粉中加入所述粗酶液，搅拌均匀，经酶解、超声波振荡 提取并过筛及真空抽滤除渣、真空浓缩后获得萝卜硫素粗提水溶液；向萝卜硫素粗提水溶液 中加入乙酸乙酯萃取、收集乙酸乙酯相并真空浓缩成膏状萝卜硫素粗提物;将膏状萝卜硫素 粗提物经冷冻干燥至恒重，即得纯度为1%~15%的萝卜硫素粗品。该方法存在的主要问题有： _新鲜西兰花食用部分含水量高达90%左右，进行干燥耗能极高且在高温环境下萝卜硫素快 速分解新鲜芥子受季节控制，难以常年生产且粗酶液中杂质和杂酶均多，水解生成的杂 质多，萝卜硫素生成率低因为萝卜硫素在水溶液中的稳定时间仅约90min，而水解时间长 达8小时，在此期间萝卜硫素大量重排或异构化，导致萝卜硫素生成率极低。由此可知，目前萝 卜硫素生广存在着生成率极低、生广时间长、能耗尚、广品纯度低、广品成本尚等共同缺陷， 有必要进一步研发新方法，提升萝卜硫素生成率和纯度、降低生产成本。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题:针对目前萝卜硫素生产中存在的因生产高温加热时 间长，萝卜硫素大量发生重排或异构化，导致萝卜硫素生成率极低，并且产品纯度低的问题， 本发明首先通过对大肠杆菌进行变异处理，得到产硫代葡萄糖苷酶的大肠杆菌，再将变异 大肠杆菌进行培养，然后对西兰花进行处理、超声提取，得到提取液，然后再通过酶解、加入 氢氧化钠、正己烷等除去油脂、金属离子、蛋白质等杂质，得到葡萄糖萝卜硫素苷溶液，再将 大肠杆菌进行发酵，向发酵液中加入葡萄糖萝卜硫素苷反应，再分别经过离心分离、c〇 2超临 界萃取、常压蒸馏、低温真空冻干，得到萝卜硫素。本发明制备的萝卜硫素产率高，纯度高，可 应用于大规模生产中，并且生产时间较常规方法减少了6~8h，纯度达到了95%以上。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是： (1) 称取3~5g牛肉膏、10~15g蛋白胨、5~7g氯化钠加入到培养皿中，再加入700~ 800mL去离子水，搅拌10~20min，制成培养基，培养菌种； (2) 选取10~20株大肠杆菌，用波长为280nm紫外线照射1~2h，选取其中的变异大肠杆 菌接种到培养基上，再将培养基置于摇床中，在38~40°C下，振荡培养12~14h，将培养液放 入5000~6000r/min离心机中离心分离10~20min，弃去上清液，得到变异大肠杆菌菌种，备 用； (3) 称取100~200g西兰花，置于80~90 °C烘箱内干燥30~40min，再将干燥后的西兰花 用粉碎机粉碎，得到干西兰花粉末，将西兰花粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入200~300mL 去离子水，并置于3000~3200W超声波萃取机上，控制温度在60~70°C，超声提取30~ 40min，过滤，得到提取液； (4) 将上述提取液置于酶解罐中，同时向酶解罐中依次加入300~400mL去离子水、50~ lOOmLpH为7.1~7.3磷酸盐缓冲溶液，搅拌30~40min，再向酶解罐中依次加入0.3~0.5g果 胶酶、0.8~1.0g纤维素酶、1~3g半纤维素酶，控制酶解罐内温度为45~55 °C，搅拌反应70 ~90min，反应结束，得到西兰花酶解液； (5) 将上述西兰花酶解液放入5000~6000r/min离心机中离心分离10~20min，弃去下 层杂质，得到西兰花酶解上清液，向上清液中依次加入50~70mL0.5mol/L氢氧化钠溶液、1 ~3g氯化锌，搅拌5~lOmin，过滤，得到滤液，向滤液中加入100~200mL正己烧，搅拌10~ 20min，静置，分液，得到水相，即葡萄糖萝卜硫素苷溶液； (6) 向发酵罐中依次加入20%步骤(2)备用的变异大肠杆菌菌种、10~20g蛋白胨、3~5g 酵母膏、100~200mLpH为7.2~7.4磷酸盐缓冲液、300~400mL去离子水，控制温度在30~40 °(：下，搅拌发酵10~12h，向发酵液中加入上述葡萄糖萝卜硫素苷溶液，保温搅拌反应40~ 60min，再将反应液离心分离10~20min，弃去下层杂质，得到萝卜硫素混合液； (7) 将上述萝卜硫素混合液加入到C02超临界萃取仪中，控制萃取压力为20~30MPa，萃 取温度为35~40°C，C0 2的流量为25~35kg/h，萃取10~20min，得到萝卜硫素溶液，将萝卜硫 素溶液常温下减压蒸馏至膏状，再置于-10~_15°C真空冷冻干燥器内，冻干5~6h，得到淡 黄色粉末，即萝卜硫素。
[0006] 本发明的应用方法:称取3~5g上述制备的从西兰花中提取的萝卜硫素，将其溶解 于150~200mL30~40°C温水中，搅拌2~3min后口服，每天服用3~4次，服用5~7天后，发现 恶性癌细胞没有发生病变和转移，本发明可以有效的预防癌症及抑制癌细胞的转移和病 变。
[0007] 本发明与其他方法相比，有益技术效果是： (1) 本发明主要通过酶解、加入氢氧化钠、正己烷等除去油脂、金属离子、蛋白质等杂 质，并且通过发酵得到的硫代葡萄糖苷酶无其他杂酶，因此提高了萝卜硫素的其提取率和纯 度，提取率达到50%以上，纯度达到了95%以上； (2) 本发明较常规制备方法生产时间减少了6~8h。
【具体实施方式】
[0008] 首先称取3~5g牛肉膏、10~15g蛋白胨、5~7g氯化钠加入到培养皿中，再加入700 ~800mL去离子水，搅拌10~20min，制成培养基，培养菌种;选取10~20株大肠杆菌，用波长 为280nm紫外线照射1~2h，选取其中的变异大肠杆菌接种到培养基上，再将培养基置于摇 床中，在38~40°C下，振荡培养12~14h，将培养液放入5000~6000r/min离心机中离心分离 10~20min，弃去上清液，得到变异大肠杆菌菌种，备用;称取100~200g西兰花，置于80~90 °C烘箱内干燥30~40min，再将干燥后的西兰花用粉碎机粉碎，得到干西兰花粉末，将西兰 花粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入200~300mL去离子水，并置于3000~3200W超声波萃取 机上，控制温度在60~70°C，超声提取30~40min，过滤，得到提取液;将上述提取液置于酶 解罐中，同时向酶解罐中依次加入300~400mL去离子水、50~lOOmLpH为7.1~7.3磷酸盐缓 冲溶液，搅拌30~40min，再向酶解罐中依次加入0.3~0.5g果胶酶、0.8~1.0g纤维素酶、1 ~3g半纤维素酶，控制酶解罐内温度为45~55°C，搅拌反应70~90min，反应结束，得到西兰 花酶解液;将上述西兰花酶解液放入5000~6000r/min离心机中离心分离10~20min，弃去 下层杂质，得到西兰花酶解上清液，向上清液中依次加入50~70mL0.5mol/L氢氧化钠溶液、 1~3g氯化锌，搅拌5~1 Omin，过滤，得到滤液，向滤液中加入100~200mL正己烧，搅拌10~ 20min，静置，分液，得到水相，即葡萄糖萝卜硫素苷溶液；向发酵罐中依次加入20%备用的变 异大肠杆菌菌种、10~20g蛋白胨、3~5g酵母膏、100~200mLpH为7.2~7.4磷酸盐缓冲液、 300~400mL去离子水，控制温度在30~40°C下，搅拌发酵10~12h，向发酵液中加入上述葡 萄糖萝卜硫素苷溶液，保温搅拌反应40~60min，再将反应液离心分离10~20min，弃去下层 杂质，得到萝卜硫素混合液;将上述萝卜硫素混合液加入到C0 2超临界萃取仪中，控制萃取压 力为20~30MPa，萃取温度为35~40°C，C02的流量为25~35kg/h，萃取10~20min，得到萝卜 硫素溶液，将萝卜硫素溶液常温下减压蒸馏至膏状，再置于-10~_15°C真空冷冻干燥器内， 冻干1~2h，得到淡黄色粉末，即萝卜硫素。
[0009] 实例 1 首先称取3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g氯化钠加入到培养皿中，再加入700mL去离子水，搅 拌10min，制成培养基，培养菌种;选取10株大肠杆菌，用波长为280nm紫外线照射lh，选取其 中的变异大肠杆菌接种到培养基上，再将培养基置于摇床中，在38°C下，振荡培养12h，将培 养液放入5000r/min离心机中离心分离10min，弃去上清液，得到变异大肠杆菌菌种，备用； 称取100g西兰花，置于80°C烘箱内干燥30min，再将干燥后的西兰花用粉碎机粉碎，得到干 西兰花粉末，将西兰花粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入200mL去离子水，并置于3000W超声 波萃取机上，控制温度在60°C，超声提取30min，过滤，得到提取液;将上述提取液置于酶解 罐中，同时向酶解罐中依次加入300mL去离子水、50mLpH为7.1磷酸盐缓冲溶液，搅拌30min， 再向酶解罐中依次加入〇.3g果胶酶、0.8g纤维素酶、lg半纤维素酶，控制酶解罐内温度为45 °C，搅拌反应70min，反应结束，得到西兰花酶解液;将上述西兰花酶解液放入5000r/min离 心机中离心分离lOmin，弃去下层杂质，得到西兰花酶解上清液，向上清液中依次加入 50mL0.5mol/L氢氧化钠溶液、lg氯化锌，搅拌5min，过滤，得到滤液，向滤液中加入lOOmL正 己烷，搅拌lOmin，静置，分液，得到水相，即葡萄糖萝卜硫素苷溶液；向发酵罐中依次加入20% 备用的变异大肠杆菌菌种、l〇g蛋白胨、3g酵母膏、lOOmLpH为7.2磷酸盐缓冲液、300mL去离 子水，控制温度在30°C下，搅拌发酵10h，向发酵液中加入上述葡萄糖萝卜硫素苷溶液，保温 搅拌反应40min，再将反应液离心分离lOmin，弃去下层杂质，得到萝卜硫素混合液;将上述萝 卜硫素混合液加入到C0 2超临界萃取仪中，控制萃取压力为20MPa，萃取温度为35°C，C02的流 量为25kg/h，萃取lOmin，得到萝卜硫素溶液，将萝卜硫素溶液常温下减压蒸馏至膏状，再置 于-10°C真空冷冻干燥器内，冻干2h，得到淡黄色粉末，即萝卜硫素。
[0010]称取3g上述制备的从西兰花中提取的萝卜硫素，将其溶解于150mL30°C温水中，搅 拌2min后口服，每天服用3次，服用7天后，发现恶性癌细胞没有发生病变和转移，本发明可 以有效的预防癌症及抑制癌细胞的转移和病变。
[0011]实例2 首先称取4g牛肉膏、13g蛋白胨、6g氯化钠加入到培养皿中，再加入750mL去离子水，搅 拌15min，制成培养基，培养菌种;选取15株大肠杆菌，用波长为280nm紫外线照射1.5h，选取 其中的变异大肠杆菌接种到培养基上，再将培养基置于摇床中，在39°C下，振荡培养13h，将 培养液放入5500r/min离心机中离心分离15min，弃去上清液，得到变异大肠杆菌菌种，备 用;称取150g西兰花，置于85°C烘箱内干燥35min，再将干燥后的西兰花用粉碎机粉碎，得到 干西兰花粉末，将西兰花粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入250mL去离子水，并置于3100W超 声波萃取机上，控制温度在65°C，超声提取35min，过滤，得到提取液;将上述提取液置于酶 解罐中，同时向酶解罐中依次加入350mL去离子水、75mLpH为7.2磷酸盐缓冲溶液，搅拌 35min，再向酶解罐中依次加入0.4g果胶酶、0.9g纤维素酶、2g半纤维素酶，控制酶解罐内温 度为50°C，搅拌反应80min，反应结束，得到西兰花酶解液;将上述西兰花酶解液放入5500r/ min离心机中离心分离15min，弃去下层杂质，得到西兰花酶解上清液，向上清液中依次加入 60mL0.5mo 1/L氢氧化钠溶液、2g氯化锌，搅拌8min，过滤，得到滤液，向滤液中加入150mL正 己烷，搅拌15min，静置，分液，得到水相，即葡萄糖萝卜硫素苷溶液；向发酵罐中依次加入20% 备用的变异大肠杆菌菌种、15g蛋白胨、4g酵母膏、150mLpH为7.3磷酸盐缓冲液、350mL去离 子水，控制温度在35°C下，搅拌发酵llh，向发酵液中加入上述葡萄糖萝卜硫素苷溶液，保温 搅拌反应50min，再将反应液离心分离15min，弃去下层杂质，得到萝卜硫素混合液;将上述萝 卜硫素混合液加入到C0 2超临界萃取仪中，控制萃取压力为25MPa，萃取温度为38°C，C02的流 量为30kg/h，萃取15min，得到萝卜硫素溶液，将萝卜硫素溶液常温下减压蒸馏至膏状，再置 于-13 °C真空冷冻干燥器内，冻干1.5h，得到淡黄色粉末，即萝卜硫素。
[0012]称取4g上述制备的从西兰花中提取的萝卜硫素，将其溶解于175mL35°C温水中，搅 拌3min后口服，每天服用4次，服用6天后，发现恶性癌细胞没有发生病变和转移，本发明可 以有效的预防癌症及抑制癌细胞的转移和病变。
[0013]实例3 首先称取5g牛肉膏、15g蛋白胨、7g氯化钠加入到培养皿中，再加入800mL去离子水，搅 拌20min，制成培养基，培养菌种;选取20株大肠杆菌，用波长为280nm紫外线照射2h，选取其 中的变异大肠杆菌接种到培养基上，再将培养基置于摇床中，在40°C下，振荡培养14h，将培 养液放入6000r/min离心机中离心分离20min，弃去上清液，得到变异大肠杆菌菌种，备用； 称取200g西兰花，置于90°C烘箱内干燥40min，再将干燥后的西兰花用粉碎机粉碎，得到干 西兰花粉末，将西兰花粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入300mL去离子水，并置于3200W超声 波萃取机上，控制温度在70°C，超声提取40min，过滤，得到提取液;将上述提取液置于酶解 罐中，同时向酶解罐中依次加入400mL去离子水、lOOmLpH为7.3磷酸盐缓冲溶液，搅拌 4〇min，再向酶解罐中依次加入〇. 5g果胶酶、1. Og纤维素酶、3g半纤维素酶，控制酶解罐内温 度为55°C，搅拌反应90min，反应结束，得到西兰花酶解液;将上述西兰花酶解液放入6000r/ min离心机中离心分离20min，弃去下层杂质，得到西兰花酶解上清液，向上清液中依次加入 70mL0.5mol/L氢氧化钠溶液、3g氯化锌，搅拌lOmin，过滤，得到滤液，向滤液中加入200mL正 己烷，搅拌20min，静置，分液，得到水相，即葡萄糖萝卜硫素苷溶液；向发酵罐中依次加入20% 备用的变异大肠杆菌菌种、20g蛋白胨、5g酵母膏、200mLpH为7.4磷酸盐缓冲液、400mL去离 子水，控制温度在40°C下，搅拌发酵12h，向发酵液中加入上述葡萄糖萝卜硫素苷溶液，保温 搅拌反应60min，再将反应液离心分离20min，弃去下层杂质，得到萝卜硫素混合液;将上述萝 卜硫素混合液加入到C0 2超临界萃取仪中，控制萃取压力为30MPa，萃取温度为40°C，C02的流 量为35kg/h，萃取20min，得到萝卜硫素溶液，将萝卜硫素溶液常温下减压蒸馏至膏状，再置 于-15°C真空冷冻干燥器内，冻干lh，得到淡黄色粉末，即萝卜硫素。
[0014]称取5g上述制备的从西兰花中提取的萝卜硫素，将其溶解于00mL40°C温水中，搅拌 3min后口服，每天服用4次，服用5天后，发现恶性癌细胞没有发生病变和转移，本发明可以 有效的预防癌症及抑制癌细胞的转移和病变。
【主权项】
1. 一种从西兰花中提取萝卜硫素的制备方法，其特征在于具体制备步骤为： (1) 称取3~5g牛肉膏、10~15g蛋白胨、5~7g氯化钠加入到培养皿中，再加入700~ 800mL去离子水，搅拌10~20min，制成培养基，培养菌种； (2) 选取10~20株大肠杆菌，用波长为280nm紫外线照射1~2h，选取其中的变异大肠杆 菌接种到培养基上，再将培养基置于摇床中，在38~40°C下，振荡培养12~14h，将培养液放 入5000~6000r/min离心机中离心分离10~20min，弃去上清液，得到变异大肠杆菌菌种，备 用； (3) 称取100~200g西兰花，置于80~90 °C烘箱内干燥30~40min，再将干燥后的西兰花 用粉碎机粉碎，得到干西兰花粉末，将西兰花粉末加入到烧杯中，向烧杯中加入200~300mL 去离子水，并置于3000~3200W超声波萃取机上，控制温度在60~70°C，超声提取30~ 40min，过滤，得到提取液； (4) 将上述提取液置于酶解罐中，同时向酶解罐中依次加入300~400mL去离子水、50~ IOOmLpH为7.1~7.3磷酸盐缓冲溶液，搅拌30~40min，再向酶解罐中依次加入0.3~0.5g果 胶酶、0.8~1.0 g纤维素酶、1~3g半纤维素酶，控制酶解罐内温度为45~55 °C，搅拌反应70 ~90min，反应结束，得到西兰花酶解液； (5) 将上述西兰花酶解液放入5000~6000r/min离心机中离心分离10~20min，弃去下 层杂质，得到西兰花酶解上清液，向上清液中依次加入50~70mL0.5mol/L氢氧化钠溶液、1 ~3g氯化锌，搅拌5~IOmin，过滤，得到滤液，向滤液中加入100~200mL正己烧，搅拌10~ 20min，静置，分液，得到水相，即葡萄糖萝卜硫素苷溶液； (6) 向发酵罐中依次加入20%步骤(2)备用的变异大肠杆菌菌种、10~20g蛋白胨、3~5g 酵母膏、100~200mLpH为7.2~7.4磷酸盐缓冲液、300~400mL去离子水，控制温度在30~40 °(：下，搅拌发酵10~12h，向发酵液中加入上述葡萄糖萝卜硫素苷溶液，保温搅拌反应40~ 60min，再将反应液离心分离10~20min，弃去下层杂质，得到萝卜硫素混合液； (7) 将上述萝卜硫素混合液加入到CO2超临界萃取仪中，控制萃取压力为20~30MPa，萃取 温度为35~40°C，C0 2的流量为25~35kg/h，萃取10~20min，得到萝卜硫素溶液，将萝卜硫素 溶液常温下减压蒸馏至膏状，再置于-10~_15°C真空冷冻干燥器内，冻干1~2h，得到淡黄 色粉末，即萝卜硫素。
【文档编号】A61K31/26GK105949098SQ201610553257
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】仇颖莹, 孟浩影
【申请人】仇颖莹