一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞及制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞及制备方法及应用，制备方法为：1)扩增人间充质干细胞；2)通过RNA干扰技术抑制人间充质干细胞中的ESE?3基因，所述ESE?3基因如SEQ ID NO:1所示，得到耐缺血缺氧的人间充质干细胞。实验证明，通过抑制人间充质干细胞的ESE?3基因的表达，能明显提高间充质干细胞在缺血缺氧环境的生存能力，本发明的人间充质干细胞可以明显减少在缺血缺氧状态导致的死亡。本发明技术简单，易于实现，本发明的耐缺血缺氧的人间充质干细胞可以用于组织损伤修复以及血管新生。
【专利说明】
一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞及制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，与细胞治疗产品有关，具体涉及一种耐缺血缺氧的人 间充质干细胞及制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 干细胞是各种组织细胞更新换代的种子细胞，是人体细胞的生产工厂。干细胞通 过自我更新，产生和其相同的子代细胞，维持体内种子细胞数量的稳定;通过多向分化，变 成多种不同的、能执行某些特定生理功能的组织细胞，替代正常生理代谢或受损的功能细 胞，在体外特定的诱导条件下可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内 皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。细胞替代治疗现已 成为治疗免疫性疾病、组织损伤和退行性疾病的新策略、新技术。
[0003] 成体干细胞以其获得途径便利和不存在伦理制约等优势成为细胞治疗的首选细 胞。其中间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是开发细胞治疗非常理想的干细胞 种类。MSC细胞治疗已经广泛应用在了许多重大疾病治疗研究中，公共临床试验数据库 cl inicaltrials.gov的数据显示，全球已有近400例临床试验进行了注册，所涉及的疾病包 括GVHD，肝病，心脏病，脊髓损伤等等，目前大多数的临床试验处于临床I期、II期或I/II期。 目前美国已有数家制药公司获得了干细胞药物，2010年7月FDA核准了 一种人间充质干细胞 (商品名prochymal)的孤儿药，用于I型糖尿病的治疗。2012年又扩大核准此孤儿药用于治 疗急性移植物抗宿主病(GVHD)。其他国家如韩国也已经批准了3例干细胞治疗药物，分别应 用于软骨再生、心肌梗死和肠病。
[0004] 但是在人体损伤的局部，经常会出现缺血缺氧的状况，导致干细胞在损伤局部生 存条件恶劣。通过调控干细胞某些基因的表达，可以形成提高干细胞在恶劣环境生存能力 并促进再生修复的新策略，安全有效地应用于损伤修复。
[0005] ESE-3基因属于ets家族，Ets家族在多种生理过程中发挥重要作用，包括细胞的增 殖分化、迀移凋亡、血管发生和器官形成等。所有的Ets家族蛋白都有一个高度保守的DNA结 合结构域，即Ets结构域，该结构域有一个螺旋转螺旋的侧翼，可以结合有GGA(A/T)序列的 DNA结合位点，从而实现对靶基因的转录激活或抑制，调节细胞生理功能。ESE-3是在2000年 分离出的一个新的Ets家族转录因子，目前对其功能研究尚少。
[0006] 在损伤部位缺血缺氧，同时产生大量的炎症因子。在Silverman等(Silverman ES, Baron RM，Palmer LJ，Le L，Hallock A，et al.(2002)Constitutive and cytokine-induced expression of the ETS transcription factor ESE_3in the lung.Am J Respir Cell Mol Biol 27:697-704.)的研究发现炎症因子可以上调ESE-3的表达。而在炎 症应答过程中，炎症因子也可以促进干细胞的凋亡（Akiyama K，Chen C，Wang D，et al.Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS_ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis.Cell stem cell，2012,10(5) :544-55. )J_SESE_3是否能促 进干细胞凋亡并未有任何报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞的制备方法。
[0009] 本发明的第三个目的是提供一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞在制备耐缺血缺 氧干细胞药物的应用。
[0010]本发明的技术方案概述如下：
[0011] -种耐缺血缺氧的人间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0012] 1)扩增人间充质干细胞；
[0013] 2)通过RNA干扰技术抑制人间充质干细胞中的ESE-3基因，所述ESE-3基因如SEQ ID NO: 1所示，得到耐缺血缺氧的人间充质干细胞。
[0014] 上述方法制备的一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞。
[0015] 上述一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞在制备耐缺血缺氧干细胞药物的应用。
[0016] 本发明的优点：
[0017]实验证明，通过抑制人间充质干细胞的ESE-3基因的表达，能明显提高间充质干细 胞在缺血缺氧环境的生存能力，本发明的人间充质干细胞可以明显减少在缺血缺氧状态导 致的死亡。本发明技术简单，易于实现，通过将普通间充质干细胞转染靶向ESE-3基因的 s iRNA，可以获得耐缺血缺氧的人间充质干细胞，通过消化、洗涤、加入保护液、调整细胞浓 度及包装制备成干细胞产品；该产品可以为新鲜制剂，也可以为冻存制剂。该产品可以用于 组织损伤修复以及血管新生。
【附图说明】
[0018] 图1为人胎盘间充质干细胞形态。
[0019] 图2为靶向人间充质干细胞中的ESE-3基因的siRNA(siESE-3组，即耐缺血缺氧的 人间充质干细胞组)能明显降低ESE-3蛋白的表达，s i Con组为转染无意对照的s i RNA。
[0020] 图3为：siCon组和siESE-3组的细胞形态，耐缺血缺氧的人间充质干细胞能明显抵 抗重度低氧引起的细胞死亡（图3A为siCon组，图3B为siESE-3组）。
[0021] 图4为：siCon组和siESE-3组的在不同氧浓度下增殖情况直方图，耐缺血缺氧的人 间充质干细胞组在1 % 〇2时能明显抵抗重度低氧引起的细胞死亡。
[0022] 图5为：SiCon组和SiESE-3组的细胞形态，耐缺血缺氧的人间充质干细胞能明显抵 抗去血清引起的细胞死亡（图5A为siCon组，图5B为siESE-3组）。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0024] 实施例1
[0025]稳定干扰ESE-3基因的耐缺血缺氧的人间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤： [0026]人胎盘间充质干细胞的分离、培养、ESE-3基因表达检测及转染靶向ESE-3的siRNA 的胎盘间充质干细胞制备。
[0027] 1)胎盘间充质干细胞的分离:将人胎盘组织机械剪碎，按专业人员所熟知的酶消 化法分离获得胎盘间充质干细胞。
[0028] 2)胎盘间充质干细胞的扩增培养:将上述细胞按0.5-5 X105/cm2的密度接种到培 养瓶中，置于37°C、饱和湿度、5%的C02培养箱中进行原代细胞培养。所用培养基为无血清 培养基。细胞培养到80-90 %融合时，用trypLE ?消化，按分种率1:3接种到新培养瓶中培 养。经过数次传代，所获得间充质干细胞可以用于后续操作；
[0029] 3)按专业人员所熟知的方法，用携带靶向ESE-3的shRNA的慢病毒载体(shRNA慢病 毒载体为商品化载体）感染间充质干细胞，shRNA序列GCCGAGCTATGAGATATTA TCAAGAG TAATATCTCATAGCTCGGC(SEQ ID N0:2)。细胞扩增后，取少量细胞检测转染了靶向ESE-3基因 s iRNA的间充质干细胞ESE-3基因表达情况。其他细胞继续培养。
[0030] 4)通过一定次数的扩增，待最终制备代次的感染靶向ESE-3的shRNA的慢病毒的间 充质干细胞培养到80-90 %融合时，用胰蛋白酶消化，通过离心、计数、用含2 %人血白蛋白 和10%二甲基亚砜(DMS0)的无菌生理盐水按一定的细胞浓度重悬细胞，制备冻存的间充质 干细胞产品，放液氮中长期储存。
[0031 ]结果:我们获得的细胞形态为均一的长梭形（图1 )，将细胞进行流式检测分析，符 合间充质干细胞特征，⑶1113、邙19丄034、邙45、!11^-01?为阴性（阳性率均小于2%)，邙73、 CD90、⑶105为阳性（阳性率均大于95%)，我们成功分离人胎盘间充质干细胞。通过RT-PCR 方法检测，发现人胎盘间充质干细胞表达ESE-3基因。通过转染靶向ESE-3的shRNA慢病毒， 胎盘间充质干细胞的ESE-3基因被明显抑制（图2)。
[0032] 实施例2
[0033] 无外源基因插入的耐缺血缺氧的人间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0034] 1)分离、扩增人间充质干细胞:将脐带组织机械剪碎，按常规的组织块贴壁法分离 脐带间充质干细胞。
[0035] 2)将获得的脐带组织块置于37°C、饱和湿度、5%的C02培养箱中进行原代细胞培 养。所用培养基为含10%胎牛血清的DF12培养基。细胞培养到80-90%融合时，用胰蛋白酶 消化，按分种率1:3接种到新培养瓶中培养。经过数次传代，所获得间充质干细胞可以用于 后续操作；
[0036] 3)通过脂质体转染方法，将合成靶向ESE-3基因的siRNA干扰片段（靶向序列： GCCGAGCTATGAGATATTA) (SEQ ID N0:3)，转染到人间充质干细胞中。48小时后取少量细胞检 测转染了靶向ESE-3基因 siRNA的间充质干细胞ESE-3基因表达情况。
[0037] 4)待转染人ESE-3基因的siRNA干扰片段的间充质干细胞培养到80-90%融合时， 用胰蛋白酶消化，通过离心、计数、用含2%人血白蛋白的无菌生理盐水按一定的细胞浓度 重悬细胞，将细胞悬液罐装到无菌血袋中，制备成耐缺血缺氧的人间充质干细胞制剂。
[0038] 实施例3
[0039]干扰ESE-3基因能明显提高间充质干细胞在重度低氧条件下的生存。
[0040]我们通过三气培养箱模拟低氧环境，常氧条件为21 %氧含量，重度低氧为1 %氧含 量，用含2%血清的培养基培养细胞。用携带靶向ESE-3的shRNA的慢病毒载体感染间充质干 细胞，shRNA序列GCCGAGCTATGAGATATTA TCAAGAG TAATATCTCATAGCTCGGC(SEQ ID N0:2)，对 照组用无义的shRNA的慢病毒载体，将两组细胞分别都接种到6孔板和96孔板，常氧环境为 21 %氧含量，5 %二氧化碳，低氧组放在1 %氧含量，5 %二氧化碳的环境培养72小时，6孔板 细胞进行拍照观察细胞形态，96孔板细胞进行MTT检测。
[0041 ] 结果：显示，干扰ESE-3能明显提高在低氧环境下MSC的生存能力，干扰ESE-3后， MSC能明显抵抗重度低氧引起的细胞死亡（图3)，通过MTT检测，发现证实上述结果，干扰 ESE-3的MSC组0D值明显高于单纯低氧组（图4)。
[0042] 实施例4
[0043]干扰ESE-3基因能明显提高间充质干细胞在去血清条件下的生存。我们通过去血 清模拟缺血情况。培养体系用无血清培养基，转染靶向E S E - 3的s i R N A，靶向序列： GCCGAGCTATGAGATATTA(SEQ ID N0:3)，对照组用无义的siRNA，将两组细胞分别都培养在6 孔板和96孔板，培养72小时，6孔板细胞进行拍照观察细胞形态，96孔板细胞进行MTT检测。 [0044] 结果:72小时后，单纯去血清组MSC出现明显的死亡情况，而干扰ESE-3后，能明显 抵抗去血清引起的细胞死亡（图5)。通过MTT检测，发现证实上述结果，干扰ESE-3的MSC组0D 值明显高于单纯去血清组。
[0045] 实验证明，本发明的耐缺血缺氧的人间充质干细胞，通过消化、洗涤、加入保护液、 调整细胞浓度及包装制备成干细胞产品；该产品可以为新鲜制剂，也可以为冻存制剂。
[0046] 本发明的耐缺血缺氧的人间充质干细胞可以用于缺血性疾病等组织损伤性疾病 的治疗。
【主权项】
1. 一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 扩增人间充质干细胞； 2) 通过RNA干扰技术抑制人间充质干细胞中的ESE-3基因，所述ESE-3基因如SEQ ID NO: 1所示，得到耐缺血缺氧的人间充质干细胞。2. 权利要求1的方法制备的一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞。3. 权利要求2的一种耐缺血缺氧的人间充质干细胞在制备耐缺血缺氧干细胞药物的应 用。
【文档编号】A61P9/10GK105969735SQ201610311226
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】韩之波, 池颖, 韩忠朝
【申请人】中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）