一种榆黄蘑菌种鉴别的方法及专用dna条形码片段的制作方法
【专利摘要】本发明公开了榆黄蘑菌种鉴别的方法及专用DNA条形码片段。本发明提供了DNA条形码片段或与所述DNA条形码片段同源性大于99％的片段在鉴别或辅助鉴别榆黄蘑菌种中的应用；所述DNA条形码片段的核苷酸序列为序列3。本发明的实验证明，本发明提供的榆黄蘑DNA条形码片段，其可以用于鉴别榆黄蘑菌种，用该片段鉴别有利于缩短榆黄蘑菌种鉴定时间，提高鉴定准确性。
【专利说明】
一种榆黄蘑菌种鉴别的方法及专用DNA条形码片段
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种榆黄蘑菌种鉴别的方法及专用DNA条形 码片段。
【背景技术】
[0002] 我国是世界上最大的食用菌生产、消费大国，年产量约占世界食用菌产量75%。榆 黄蘑味道鲜美，营养丰富，含蛋白质、维生素和矿物质等多种营养成分，其中氨基酸含量尤 为丰富，且必需氨基酸含量高，属高营养、低热量食品。长期食用，有降低血压、降低胆固醇 含量的功能，是老年人心血管疾病患者和肥胖症患者的理想保健食品。榆黄蘑还具有滋补 强壮功效。不仅受国人喜爱，而且在国际市场较为抢手，生产和经营效益均显著高于一般农 产品。菌种在榆黄蘑产业的发展中起着基础性的、重要的、不可替代的作用。一些假冒伪劣 菌种充斥市场，严重损害产业发展。通过栽培试验检测榆黄蘑菌种，耗时较多。
[0003] 因此，建立一种快速可靠的鉴定榆黄蘑菌种的方法迫在眉睫。DNA条形码技术应用 一个标准的DNA序列，对物种进行快速准确鉴定，可实现对榆黄蘑菌种快速简便可靠的物种 鉴定。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种DNA片段。
[0005] 本发明提供的DNA片段，为如下1)或2)或3):
[0006] 1)、序列3所示的DNA片段；
[0007] 2)、序列3第21-381位核苷酸所示的DNA片段；
[0008] 3)、为与1)或2)所示片段的核苷酸序列同源性大于99%的片段。
[0009]本发明的另一个目的是提供所述DNA片段的新用途。
[0010]本发明提供了所述DNA片段在鉴别或辅助鉴别榆黄蘑菌种中的应用。
[0011] 本发明第3个目的是提供检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质 的新用途。
[0012] 本发明提供了检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质在鉴别榆黄 蘑菌种中的应用。
[0013] 上述应用中，所述检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质为如下 1)或 2):
[0014] 1)用于扩增所述DNA条形码片段的引物对；
[0015] 2)含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。
[0016] 上述应用中，所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2 所示的单链DNA分子组成。
[0017]或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。
[0018] 或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为lOymol/L。
[0019] 本发明第4个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别榆黄蘑菌种的方法。
[0020] 本发明提供的方法，包括如下步骤:检测待测样品中是否含有所述DNA片段;如果 含有，则待测样品为或候选为榆黄蘑菌种;如果不含有，则待测样品不为或候选不为榆黄蘑 菌种。
[0021] 上述方法中，
[0022] 所述检测待测样品中是否含有所述DNA片段的方法包括如下步骤：
[0023] 1)用序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组 成的引物对对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0024] 2)测序所述PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物的序列与所述DNA片段进行比对，若 同源性大于99%，则待测样品中含有所述DNA片段，若同源性小于等于99%，则待测样品中 不含有所述DNA片段。
[0025]上述方法中，
[0026] 所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA。
[0027] 本发明第5个目的是提供检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质。
[0028] 本发明提供的检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质，其为如下 1)或 2):
[0029] 1)用于扩增所述DNA条形码片段的引物对；
[0030] 2)含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。
[0031] 上述物质中，所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2 所示的单链DNA分子组成。
[0032]或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。
[0033] 或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为lOymol/L。
[0034] 本发明的实验证明，为克服栽培试验鉴定榆黄蘑菌种的缺陷，本发明提供了一种 榆黄蘑(Pleurotus 〇;11：1'；[110卩;[1631：118)菌种0嫩条形码鉴定方法，可以快速准确地鉴别榆黄 蘑菌种;采用榆黄蘑DNA条形码片段，其可以用于鉴别榆黄蘑菌种，用该片段鉴别有利于缩 短榆黄蘑菌种鉴定时间，提高鉴定准确性。
【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 实施例1、榆黄蘑菌种鉴别DNA条形码片段的获得及方法的建立
[0038] 1、榆黄蘑菌种的基因组DNA获得
[0039]提取榆黄蘑菌种的基因组DNA。
[0040] 2、PCR 扩增
[00411以上述1得到的基因组DNA为模板，用引物7 28F和引物1567R进行PCR扩增。
[0042] 728F: 5，-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3，（序列 1)
[0043] 1567R:5，-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3'（序列2)
[0044] 上述PCR扩增体系为如下表1:
[0045] 表1为PCR反应体系的组成(25yL)
[0047] 上述PCR扩增程序为:94°C预变性5min;94°C变性30s，65°C退火55s，每个循环降低 1°C，72°C延伸9〇8，10个循环;94°(：变性3〇8,55°(：退火558,72°(：延伸9〇8,36个循环 ；最后72 °C7min〇
[0048] 得到大约850bp的PCR扩增产物。
[0049] 将大约850bp的PCR扩增产物送去测序，测序引物为728F和Ef jr;引物序列为： Efjr:5 '-TGYTCNCGRGTYTGNCCRTCYTT-3 '。
[0050]该PCR产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，其中序列3第1-20位为上游引物 728F，序列3第382-404位为下游引物Efjr的反向互补序列，该序列所示的片段或序列3第 21-381为榆黄蘑菌种鉴别DNA条形码片段。
[0051 ]榆黄蘑菌种鉴别DNA条形码片段可用于鉴别榆黄蘑菌种，具体方法如下：
[0052]检测待测样品的基因组中是否含有榆黄蘑标准鉴别DNA条形码片段或含有与其同 源性在99%以上的片段，若含有，则待测样品是榆黄蘑菌种，若不含有，则待测样品不是榆 黄蘑菌种。
[0053]实施例2、鉴别榆黄蘑菌种 [0054] 1、本发明方法特异性检测
[0055] 分别提取已知品种的榆黄蘑菌种、鲍鱼^(Pleurotus abalonus)菌种的基因组 DNA〇
[0056] 以各品种的基因组DNA作为模板，用上述引物728F和1567R扩增，得到各品种的PCR 产物。
[0057] 将各品种的PCR产物送去测序，结果如下：
[0058]已知品种的榆黄蘑菌种的PCR产物的核苷酸序列为序列3(榆黄蘑菌种鉴别DNA条 形码片段）。
[0059]已知品种的鲍鱼菇菌种的PCR产物的核苷酸序列为序列4(序列4第1-20位为上游 引物728F，序列4第385-407位为下游引物Efjr的反向互补序列）；
[0060]已知品种的榆黄蘑菌种用本发明方法也鉴别为榆黄蘑菌种；
[0061 ]已知品种的鲍鱼菇菌种的PCR产物的序列4第21-384位核苷酸与榆黄蘑菌种鉴别 DNA条形码片段序列3第21-381位核苷酸进行比对，同源性为75.1%，已知品种的鲍鱼菇菌 种用本发明方法鉴别不为榆黄蘑菌种。
[0062] 2、ITS鉴定与本发明方法比较
[0063] 分别提取已知品种的榆黄蘑菌种、鲍鱼^(Pleurotus abalonus)菌种的基因组 DNA〇
[0064] 以各品种的基因组DNA作为模板，用上述引物ITS1和引物ITS4扩增，得到各品种的 PCR产物。
[0065] ITS1:5 '-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '
[0066] ITS4:5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '
[0067] 上述PCR扩增体系为表2:
[0068] 表2 PCR反应体系的组成（25yL)
[0071] 上述PCR扩增程序为:94 °C预变性5min; 94 °C变性30s，53 °C退火30s，72 °C延伸30s， 30个循环；最后72°C10min。
[0072] 得到700bp左右的PCR扩增产物。
[0073]将700bp左右的PCR扩增产物送去测序，得到榆黄蘑菌种ITS序列（序列5,其中1-19 位为引物ITSl，655-674位为引物ITS4反向互补序列）与鲍鱼菇菌种ITS序列（序列6,其中1-19位为引物ITSl，669-688位为引物ITS4反向互补序列）。
[0074] 序列5第20-654位与序列6第20-668位同源性为:80.2 %，异质性为19.8 %，即榆黄 蘑菌种与鲍鱼菇菌种ITS序列的异质性为19.8%。而本方法得到的两者同源性为75.1%，异 质性为24.9%。灵敏度高于ITS序列。
【主权项】
1. 一种DNA片段，为如下1)或2)或3): 1) 、序列3所示的DNA片段； 2) 、序列3第21-381位核苷酸所示的DNA片段； 3) 、为与1)或2)所示片段的核苷酸序列同源性大于99%的片段。2. 权利要求1所述的DNA片段在鉴别或辅助鉴别榆黄蘑菌种中的应用。3. 检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有权利要求1所述DNA片段的物质在鉴别榆黄蘑菌 种中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述物质为如下1)或2): 1) 用于扩增所述DNA片段的引物对； 2) 含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述引物对由序列表中序列1所示的单链 DNA分子和序列表中序列2所不的单链DNA分子组成； 或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1; 或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为lOymol/L。6. -种鉴别或辅助鉴别榆黄蘑菌种的方法，包括如下步骤:检测待测样品中是否含有 权利要求1所述DNA片段;如果含有，则待测样品为或候选为榆黄蘑菌种；如果不含有，则待 测样品不为或候选不为榆黄蘑菌种。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于： 所述检测待测样品中是否含有权利要求1所述DNA片段的方法包括如下步骤： 1) 用序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的 引物对对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； 2) 测序所述PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物的序列与所述DNA片段进行比对，若同源 性大于99%，则待测样品中含有所述DNA片段，若同源性小于等于99%，则待测样品中不含 有所述DNA片段。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于： 所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA。9. 检测榆黄蘑菌种基因组中是否含有权利要求1所述DNA片段的物质，其为如下1)或 2)： 1) 用于扩增所述DNA片段的引物对； 2) 含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。10. 根据权利要求9所述的物质，其特征在于:所述引物对由序列表中序列1所示的单链 DNA分子和序列表中序列2所不的单链DNA分子组成； 或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1; 或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为lOymol/L。
【文档编号】C12Q1/68GK105969893SQ201610555369
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】赵鹏, 周军辉, 纪森鹏, 高兴喜
【申请人】鲁东大学