一种用于鉴定野山参与栽培人参的snp分子标记及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于鉴定野生人参与栽培人参的SNP分子标记及其检测方法，其包括如下步骤：(1)提取待检测人参样品的DNA，作为扩增模板；(2)使用上下游引物进行PCR扩增反应，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；(3)对扩增产物进行测序，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第236位的碱基。如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第236位点处为C，则样品鉴定为野生人参，如果自SEQ ID No.1所示序列的5’端起第236位点处为缺失，则样品鉴定为栽培人参。本发明能够实现野生人参和栽培人参的药材的准确鉴定。
【专利说明】
一种用于鉴定野山参与栽培人参的SNP分子标记及其检测 方法
技术领域
[0001] 本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用特异的SNP分子标记鉴定 野山参和栽培人参的方法。
【背景技术】
[0002] 人参（Panax ginseng)为五加科人参属植物和干燥根，系名贵中药材；人参具补 气、固脱、生津、益智、安神的功效，因补虚治病效果显著，临床应用日趋广泛。
[0003] 野山参是指自然生长在深山密林的原生态人参。有的野山参生长长达百年，没有 经过人工培植、没有化学肥料的成份，采集非常辛苦，药用价值极高，是一种名贵中药材。由 于野山参与栽培人参的市场价值差别极大，导致市场上通过技术手段用栽培人参假冒野山 参的事件层出不穷。目前，鉴别野山参的品质鉴别目前仍是主要沿用民间的经验性状鉴别 法，即眼观其芦、苄、体、纹、皮、须等性状来鉴定，尚不具严谨的科学性。随着科技的进步，使 假冒野山参的性状与野山参非常相似，从而导致通过性状鉴别法鉴别野山参的真伪越来越 难。虽然有研究表明野山参与栽培人参的人参皂苷类成分有所不同，但是由于单个样品的 化学成分的含量不稳定性，导致区别度不高，鉴别的准确度低。因此，提供一种快速、严谨和 准确度高的鉴别野山参与栽培人参的方法为大众所需。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是实现利用人参中叶绿体rpsl6基因 SNP分子标记对野 山参和栽培人参进行鉴别，从而确定野山参的真伪。
[0005] 本发明的一个目的在于提供野山参和栽培人参鉴定用SNP分子标记。
[0006] 本发明提供的野山参和栽培人参鉴定用SNP分子标记，位于人参叶绿体rpsl6基因 上，其核苷酸序列SEQ ID No. 1所示，其中，SEQ ID No. 1所示序列的5'端起第236位的碱基 为C或缺失。
[0007] 本发明另一个目的在于提供一种利用SNP分子标记对野山参和栽培人参鉴别的检 测方法，其包括。
[0008] (1)提取待检测人参样品的DNA，作为扩增模板；
[0009] (2)以步骤（1)中提取的DNA为模板，使用上下游引物进行PCR扩增反应，扩增含有 SEQ IDNo.l所示序列的片段；
[0010] ⑶对扩增产物进行测序，通过分析SEQ ID No.l所示的序列，确定自SEQ ID No.l 所示序列的5 '端起第236位的碱基。
[0011] 其中，如果自SEQ ID No.l所示序列的5'端起第236位点处为C，则样品鉴定为野山 参，如果自SEQ ID No.l所示序列的5'端起第236位点处为缺失，则样品鉴定为栽培人参。
[0012] 本发明通过大量的引物设计和筛选，意外地发现一对特异性好，扩增效率高的引 物，其序列为：
[0013] 上游引物：5' -TCCTCAGCTTATGGATATGC-3' ；
[0014] 下游引物:5 ' -GCAAGTAGAAGTCGAACAA-3 '。
[0015]上述引物用于扩增人参样品中的SEQ ID No. 1所示的序列。
[0016] 本发明方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的野山参和栽培人参的任何样 品。因此，能够实现野山参、栽培人参的药材、生饮片和粉未的快速、准确鉴定。
【附图说明】
[0017] 图1所示为PCR扩增后DNA的凝胶电泳图。
[0018]图2所示为野山参和栽培人参的DNA序列的比对结果，图上方DNA序列为野山参样 品ΡΗ01 (第231位-240位碱基），图下方DNA序列为栽培人参样品DH01 (第231位-240位碱基）。
【具体实施方式】
[0019] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0020] 本发明SEQ ID No. 1所示的序列为自5'端起第236位点为C的DNA序列。
[0021] 实施例1
[0022] 1)从不同产地收集的50份野山参和51份栽培人参样品，分别取0.2g药材，采用 CTAB法提取样品的基因组DNA。
[0023] 表1野山参和栽培人参样品
[0024]
[0026] 2)PCR 扩增
[0027] 引物序列为上游引物:TCCTCAGCTTATGGATATGC;下游引物:GCAAGTAGAAGTCGAACAA。 引物用无菌去离子水溶解并稀释至2ymol/yL。
[0028] 25以1^反应体系：无1^(：12的缓冲液17以1^，]\^(：121.8以以25111111〇1/1^)，(1奶1 38 1.241^ (2 · 5mmo 1 /L)，上下游引物各0 · 5yL，模板DNA lyL(约 1 OOng/yL)，Taq DNA聚合酶（5U/yL)0 · 5 yL，加灭菌双蒸水至25yL，进行PCR扩增。
[0029] PCR反应程序:在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：
[0030] 94°C预变性4min，然后94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共30个循环；然 后72 °C保温10分钟，4 °C保存。
[0031] 分别取5yL的PCR扩增产物上样，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像 仪上检测结果。（图1)。
[0032] 3)测序
[0033] PCR产物通过ABI3730/3730xl进行测序:将PCR产物用化学的方法标记荧光素后用 "电进样"的方法将带电的样品分子加到灌好电泳胶的毛细管的进样端(负极），然后在毛细 管两端加上直流电压，样品中不同大小的DNA片段开始从负极向正极移动，移动的速度受到 片段自身大小影响，片断越短移动得越快。电泳的结果是使长度不同的带电DNA片断互相分 离，并且按片段的长短的顺序通过检测窗口，产生信号，短片段先到达检测窗口，当标记有 荧光素的DNA片断移动到检测窗口时，荧光素受到激光束的激发而产生荧光信号，此荧光信 号被CCD检测器所检测并被转化为电信号传递到计算机从而获得DNA条形码序列。
[0034] 4)序列比对
[0035] 用DNASTARV7. 1完成序列的拼接，BioEdit7.0.9进行比对，利用Sequence Scannervl.O确定峰图质量。结果如图2所示（以PH01样品和DH01样品为例）。从图2中可以看 出，共获得1个SNP位点。另外通过检测，所有野山参样品的DNA序列（SEQ ID No. 1)的第236 位均为C，而所有栽培人参样品的DNA序列（SEQ ID No. 1)的第236位均为缺失，表明这个SNP 位点可特异性地用于鉴定野山参和栽培人参。
[0036] 实施例2
[0037] 基本同实施例1，所不同的是将实施例1中的野山参和栽培人参样品制备成饮片， 以该饮片为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的SNP位点。
[0038] 实施例3
[0039] 基本同实施例1，所不同的是将实施例1中的野山参和栽培人参样品制备成粉末， 以该粉末为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性地检测到上述的SNP位点。
[0040] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种野山参和栽培人参鉴定用SNP分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其中，SEQ ID No. 1所示序列的5'端起第237位的碱基为C或缺失。2. 权利要求1所述的SNP分子标记在鉴定野山参和栽培人参中的应用，其特征在于，其 中，如果自SEQ ID No. 1所示序列的5'端起第237位点处为C，则样品鉴定为野山参，如果自 SEQ ID No. 1所示序列的5'端起第237位点处为缺失，则样品鉴定为栽培人参。3. -种利用权利要求1所述的SNP分子标记对野山参和栽培人参鉴别的检测方法，其包 括如下步骤： (1) 提取待检测人参样品的DNA，作为扩增模板； (2) 以步骤（1)中提取的DNA为模板，使用上下游引物进行PCR扩增反应，扩增含有SEQ ID No. 1所示序列的片段； (3) 对扩增产物进行测序，通过分析SEQ ID No.1所示的序列，确定自SEQ ID No.1所示 序列的5 '端起第237位的碱基。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，如果自SEQ ID No.1所示序列的5'端 起第237位点处为C，则样品鉴定为野山参，如果自SEQ ID No.1所示序列的5'端起第237位 点处为缺失，则样品鉴定为栽培人参。5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，用于扩增含有SEQ ID No.1所示序列的 片段的上下游引物为： 上游引物：5 ' -TCCTCAGCTTATGGATATGC-3 ' ； 下游引物:5 ' -GCAAGTAGAAGTCGAACAA-3 '。
【文档编号】C12N15/11GK105986036SQ201610547360
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】王绪敏, 殷金龙, 郭海燕, 刘贵明, 王国良
【申请人】中国科学院北京基因组研究所