一种对水稻铜吸收和分配具有重要调控作用的蛋白OsSPL9及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明属于水稻遗传育种技术领域，涉及一种对水稻铜吸收和分配具有重要调控作用的蛋白OsSPL9及其编码基因与应用。本发明所提供的水稻OsSPL9蛋白及其编码基因在过表达的条件下，可引起水稻体内铜元素含量的增加。因此，通过基因工程的方法能利用该基因有效地调节水稻体内铜元素的含量，获得具有高含量有机铜的作物，对于增加饲料利用效率和减少环境污染均具有重要意义。
【专利说明】
一种对水稻铜吸收和分配具有重要调控作用的蛋白0sSPL9及 其编码基因与应用
技术领域
[0001]本发明设计一种通过过表达水稻〇sSPL9基因增加水稻体内铜元素含量的方法及 其在饲料中的应用。
【背景技术】
[0002] 微量元素是维持动物生命和生产不可缺少的营养素之一，具有重要的营养生理功 能。铜是一种重要的微量元素，在动物生长繁殖、新陈代谢、机体造血、维持生长性能等方面 具有不可替代的重要作用，是动物正常生长发育所必需的。在动物养殖中，铜元素(主要为 硫酸铜)常常被添加到动物饲料中，作为生长促进剂和抗菌剂而使用。但无机铜对微量元素 铁和锌具有拮抗作用，能导致锌和铁的排出量增加，造成动物体内铁和锌的缺乏；同时，粪 便中残留的无机铜也会污染环境。另外，前人的研究表明动物对有机铜的利用效率比无机 铜更高。因此，开展高效有机铜的研发，在促进动物生长的前提下，降低饲料中无机铜的添 加量，减少或消除粪便中残留的铜对环境的污染具有重要意义。本申请专利通过转基因的 手段，获得具有高含量有机铜的作物，对于增加饲料利用效率和减少环境污染均具有重要 意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种通过过表达水稻基因0SSPL9增加水稻体内铜元素含量 的方法及其在饲料中的应用。
[0004] 所述基因可为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：
[0005] 1)序列表的序列2所示的DNA分子；
[0006] 2)序列表的序列3所示的DNA分子；
[0007] 3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且过表达后增加植物体内铜元素 含量的的DNA分子；
[0008] 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且过表达后增加植物体内铜元 素含量的的DNA分子。
[0009] 上述严格条件可为在0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)、0.1 %SDS的溶液中，65°C条件下杂 交并洗膜。
[0010] 含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的 保护范围。
[0011] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体 包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基 因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片 段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使用所述基因构建重组植 物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它 们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用;此外，使用本发明的基因构建植物表达载 体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密 码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确 翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。 翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行 鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色 变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也 可不加任何选择性标记基因，直接根据表型筛选目的植物。
[0012] 扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
[0013] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到 体内铜元素含量增加的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的 植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化 的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。
[0014] 本发明设计一种通过过表达水稻基因0sSPL9的方法，增加水稻体内铜元素含量方 法及其在饲料中的应用。因此，通过基因工程的方法能利用该基因有效地调节、控制植物体 内铜元素含量，在动物饲料的生产应用中具有重要意义。
【附图说明】
[0015] 图1所示0sSPL9过表达载体。
[0016]图2所示为转基因植株中的0sSPL9表达分析。
[0017]图3所示为0sSPL9过表达转基因植株铜元素含量分析。
[0018]图4所示为0sSPL9过表达转基因植物的田间数据分析。
[0019] 图5所示为0sSPL9过表达对C0PT1、C0PT5、C0PT7表达的影响。
[0020] 图6所示为0sSPL9过表达对miR408、miR528的表达影响。
【具体实施方式】
[0021]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次或以上重复实验，结 果取平均值。
[0022] 实施例1 0sSPL9过表达转基因植株的获得
[0023] AtSPL7基因是拟南芥中一个对于铜吸收和分配均具有重要调控作用的转录因子， 在本研究中通过进化和共线性分析获得了 AtSPL7在水稻的同源基因0sSPL9。通过PCR扩增 获得0sSPL9的全长cDNA(F:
[0024] CTAGAGGATCCCCGGGTACCATGGACGCCCCCGGCG，R:
[0025] GATCGGGGAAATTCGAGCTCCTATGATGAGTAGTTCCTAG)，然后连接到由玉米 Ubiquin 启动 子启动的载体PTCK303上（图1 )，通过电击转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系 LBA4404 (Cat · No · 18313-015，Inv i trogen公司）中，获得了 Os SPL9过表达转基因植株。
[0026] 实施例2转基因植株中的0sSPL9表达分析
[0027] 为了检测转基因植株中0sSPL9基因的过表达水平，我们设计了0sSPL9特异引物 (F: AATGCAGCTTCTGGAGAGGA，R: AGGCAGCGTTAAGCCATCTA);取水稻幼苗提取RNA，进行荧光定 量分析，将〇sSPL9基因的荧光信号（以Ct值表示）与水稻基因 UBC基因（内参基因）的荧光信 号（以Ct值表示)根据公式（相对表达量=2>气其中ACt = Ct目的基因-Ct内参基因）计算出 的值作为0sSPL9基因的相对表达量。结果表明，与对照材料日本晴相比，过表达株系0E2， 0E19，0E23，0E30，0E32中0sSPL9基因的表达量都有2到4倍增加（图2)。
[0028]实施例3 0sSPL9过表达转基因植株铜元素含量增加
[0029] 对过表达株系进行铜元素含量测定，样品经过5HN03: 1HC104混合酸消化处理后， 米用ICP_OES(Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectroscopy)方法测定 铜元素含量。我们发现在幼苗时期，地上部分包括叶片和叶鞘中铜元素均增加（图3a，3b); 在成熟期，过表达株系表现为种子中铜含量增加，而其他组织没有明显变化。通过过表达水 稻0sSPL9基因，我们成功获得了铜含量增加的转基因水稻材料(图3c，3d)。
[0030]实施例4铜含量增加的0sSPL9过表达植株种子更易消化吸收
[0031]为了验证铜含量增加的水稻种子是否更易消化吸收，我们参照Tang和Wang的方 法，对野生型的种子和转基因种子进行了体外发酵实验(Tang，S.，Tan，Z.，Zhou，C.，
[0032] Jiang,Η. ,Jiang,Y.and Sheng , L . ( 2006 ) A comparison of in vitro fermentation characteristics of different botanical fractions ofmaturemaize stover.Journal of Animal and Feed Sciences 15,505.
[0033] ffang,Z.,He,Z.,Beauchemin,K.A.,Tang,S.,Zhou,C.,Han,X.,ffang,M.,Kang,J., Odongo,N.E. and Tan ,Z·(2016)Evaluation of Different Yeast Species for Improving In vitro Fermentation of Cereal Straws.Asian-Australasian Journal of Animal Sciences(AJAS)29,230-240)。结果显示，同一时间内，以转基因种子为发酵底 物的产气量比野生型的多；产生相同的气体前者更快(表1)。另外，以转基因种子为发酵底 物时体外干物质消失的比例（IVDVD)更大。这些结果说明以转基因种子为发酵底物更易被 消化。最后通过测定短链脂肪酸(VFA)的含量我们发现以转基因种子为发酵底物的实验产 生了更多的醋酸，说明以转基因种子为发酵底物可以影响代谢产物，增加代谢产物的含量 (表 2)。
[0034]表1体外发酵实验的产气参数和干物质消失率
[0035]
[0036]表2体外发酵实验短链脂肪酸和pH
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[0038] 实施例5、0sSPL9过表达转基因植物的生长发育正常
[0039]将野生型日本晴和各个过表达株系按3个重复种植于大田，每重复每材料10株，每 穴1株，株行距为20cmX 25cm，田间管理同一般大田。当植株生长到成熟期时，测量株高（自 地面至穗部顶端的高度）、有效穗(结有大于10粒种子的分蘖数）、穗粒数及千粒重。从图4可 以看出，除了个别株系如0E30生长有所影响外，大部分0sSPL9过表达株系的生长发育和野 生型都没有明显差异，发育正常。
[0040] 实施例6、0sSPL9的作用机制
[0041]为了研究0sSPL9影响水稻体内铜含量增加的分子机制，我们检测了与铜相关转运 蛋白和小RNA表达情况。取野生型和过表达株系幼苗提取RNA，进行荧光定量分析。结果表 明，参与植物体内铜吸收和转运的转运蛋白⑶PT1、⑶PT5、⑶PT7 (图5)和参与铜平衡的小 RNAmiR408、miR528的表达量在过表达株系中均有显著性变化（图6)，过表达株系中转运蛋 白和小RNA表达量均受到诱导表达，说明0sSPL9的过表达引起铜含量的增加，是通过调节下 游铜转运蛋白和铜相关小RNA表达而实现的。
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[0052]
【主权项】
1. 分离的、合成的或重组的DNA分子，其包括： (a) SEQ ID NO:2或3所示的序列； (b) DNA分子，其编码与SEQ ID NO: 2或3所示序列所编码的多肽相比，具有一个或多个 氨基酸残基的保守替代的多肽； (c) 与SEQ ID N0:2或3所示的序列具有至少90%同源性的DNA分子或编码其酶活性片段 的序列； (d) 在 0.1XSSPE、0.1XSSC 或 0.1% SDS 的溶液中，65°C 条件下与(a)、（b)、（c)中的 DNA序列杂交、洗膜且过表达后的DNA分子； (e) 与SEQ ID NO:2或3所示序列互补的序列； (f) 由于遗传密码的简并性而衍生自SEQ ID N0:2或3所示序列的序列之一。2. 分离的、合成的或重组的多肽，其包括： (a) SEQ ID N0:1所示的序列； (b) 权利要求1所述DNA分子编码的氨基酸序列； (c) 权利要求1所述DNA分子编码的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺 失和/或添加且与水稻体内铜元素含量相关的由(a)或(b)衍生的多肽。3. 含有权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多肽的重组表达载体或表达盒。4. 权利要求3所述的重组表达载体可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组 表达载体，所述植物表达载体包括双元农杆菌载体、可用于植物微弹轰击的载体外源基因 的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段， 所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3 '端。5. 扩增权利要求1所述DNA分子的引物对。6. 含有权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多肽的转基因细胞系、重组菌或重组 病毒。7. 权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多肽在调控水稻体内铜含量中的应用。8. -种调控水稻体内铜含量的方法，是将权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多 肽导入目的水稻组织或细胞中，得到体内铜含量改变的转基因水稻。9. 一种培育体内铜含量增加的水稻的方法，是过表达目的水稻中所含有的权利要求1 所述DNA分子或权利要求2所述多肽，得到体内铜含量增加的转基因水稻。10. -种培育转基因植物的方法，是将权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述多肽导 入目的植物中，得到转基因植物;所述转基因植物与所述目的植物相比，体内铜元素的含量 增加。
【文档编号】C12N15/29GK106086035SQ201610537564
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】张德春, 唐鸣凤, 陈彩艳, 毛东海, 朱玉兴, 刘成兵
【申请人】三峡大学, 中国科学院亚热带农业生态研究所